导读：（三）申请人和项目组主要成员简历，项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cad，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，项目组主要成员承诺：，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关，及时向项目负责人报送有关材料，若个人信息失实、执行项目中违反规定，申请项目如获资助，严格遵守国家自然科学基金委员会有关规定，督促项目负责人和项目组成员
FAK与E-cadherin相互作用为可疑弱阳性）。
图1 酵母双杂交（CytoTRAP系统）验证Pyk2与E-cadherin相互作用
pMyr-Lamin为阴性对照，pMyr-SB为阳性对照，E-Cad为E-Cadherin缩写，以下图示与此相同。Psos-E-Cad为诱饵蛋白。CytoTRAP系统酵母双杂交特点为两个蛋白如果不相互作用在25℃时可以生长，而在37℃则不能生长,如阴性对照pMyr-Lamin所示。两个蛋白如果相互作用则在两个温度下都能生长,如阳性对照pMyr-SB所示，pMyr-Pyk2与阳性对照相似。
第二步：原核表达E-cadherin和His-Pyk2进行GST-Pulldown。为了验证二者是直接结合，我们分别细菌中表达纯化GST-E-cadherin和His-Pyk2，可惜His-Pyk2全长非常难纯化，得不到纯化的蛋白。我们表达纯化了His-Pyk2的激酶部分。GST-Pulldown实验结果证实Pyk2的激酶部分能够与E-cadherin直接结合（图2）。
图2 原核表达E-cadherin和His-Pyk2激酶部分进行GST-Pulldown。
分别原核表达GST、GST-E-cadherin和His-Pyk2激酶部分，取等量GST、GST-E-cadherin分别与相同量的His-Pyk2激酶部分混合，加入谷胱甘肽琼脂糖珠孵育，重复洗三次，用his抗体Western检测，结果显示His-Pyk2激酶部分能够与GST-E-cadherin结合（泳道3），而不能与GST结合（泳道2），泳道1上图是纯化的His-Pyk2激酶部分的蛋白作为检测标准。
第三步：原核表达E-cadherin和细胞表达Myc-Pyk2进行GST-Pulldown。我们转染Myc-Pyk2于SYF细胞（SYF细胞株是酪氨酸激酶c-Src, Yes,和Fyn敲除的胚鼠中的成纤维细胞建成的细胞系，用这个细胞株可以排除Src等其他非受体型酪氨酸激酶的干扰。），实验结果发现GST-E-cadherin可以与真核表达的Myc-Pyk2全长结合，而GST作为对照不能与之结合（图3）。
图3 原核表达E-cadherin和细胞表达Myc-Pyk2进行GST-Pulldown。
转染Myc-Pyk2于SYF细胞，裂解细胞取上清，取等量GST、GST-E-cadherin分别与相同量的细胞上清混合，加入谷胱甘肽琼脂糖珠孵育，重复洗三次，用Myc抗体Western检测，结果显示Myc-Pyk2能够与GST-E-cadherin结合（泳道3），而不能与GST结合（泳道2），上图泳道1是细胞裂解液上清，检测到Myc-Pyk2蛋白作为Pulldown的参照。
第四步：我们在SYF细胞株中应用外源性免疫共沉淀技术验证，即Flag -E-cadherin和Myc-Pyk2共转染SYF细胞，结果证明二者仍然是相互作用的（图4）。
图4 Flag -E-cadherin和Myc-Pyk2免疫共沉淀结果
三组SYF细胞分别转染Myc-Pyk2、Flag -E-cadherin和共转（泳道1，2，3），左侧Input：Western检测蛋白表达量；右侧IP（泳道4，5，6），下图（泳道5，6）检测用Flag抗体沉淀下来的Flag -E-cadherin，结果发现Myc-Pyk2能被Flag -E-cadherin沉淀下来（上图泳道6），而对照不能（上图泳道4，5））。
上述实验都重复三次以上确保可重复性。这些数据让我们相信二者的相互作用是比较可靠的。本课题是申请者在原工作基础上的继续和深入。申请者一直专注于肿瘤信号通路的研究，尤其是肝癌的转移方面。因此对本课题的背景和技术都非常熟悉。参加人员都有良好的科研背景以及相关方面的特长。因此，我们具有完成本课题的切实可行的、扎实的工作基础。
（二）工作条件
本课题组所在学校的附属医院具有病例收集的良好条件，同时学校领导非常支持，本校及合作单位拥有国家重点实验室，具有设备完善而先进的的分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学、生物信息学、组织病理技术等实验平台。课题组的成员也具有团结协作创新的精神、求实的科学态度，多名成员已发表SCI论文，为本项研究工作提供有利的人力资源。
（三）申请人和项目组主要成员简历
三、其他附件清单
医学伦理委员会审批件。
签字和盖章页(此页自动生成,打印后签字盖章)
申 请 人：
依托单位：青岛大学
项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?
资助类别：面上项目
亚类说明：
附注说明：
申请人承诺：
我保证申请书内容的真实性。如果获得资助，我将履行项目负责人职责，严格遵守国家自然科学基金委员会的有关规定，切实保证研究工作时间，认真开展工作，按时报送有关材料。若填报失实和违反规定，本人将承担全部责任。
项目组主要成员承诺：
我保证有关申报内容的真实性。如果获得资助，我将严格遵守国家自然科学基金委员会的有关
规定，切实保证研究工作时间，加强合作、信息资源共享，认真开展工作，及时向项目负责人报送有关材料。若个人信息失实、执行项目中违反规定，本人将承担相关责任。
依托单位及合作研究单位承诺：
已按填报说明对申请人的资格和申请书内容进行了审核。申请项目如获资助，我单位保证对研究计划实施所需要的人力、物力和工作时间等条件给予保障，严格遵守国家自然科学基金委员会有关规定，督促项目负责人和项目组成员以及本单位项目管理部门按照国家自然科学基金委员会的规定及时报送有关材料。
依托单位公章
合作研究单位公章1
合作研究单位公章2
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(分享)国家自然基金标书申报体会
申报体会一：一、要抓住一个“新”字1、题目要新颖：题目是很关键的东西，要从题目上吸引人，从题目上体现出你研究的“新”来。（1）现在的研究热点。前五年，只要涉及到纳米技术的，国家自然科学基金委全部给予资助，或多或少。分析原因有二：一是这是新出现的，我们国内还是空白，需要从各个方面来加强；二是这方面的标书少，中标率高。（2）别人可能没有听过的名词。2001年吧，有个学者的标书是“数字细胞”，一下就把人吸引住了，最后这个课题拿了一百多万；其实就是用仪器记录细胞信号，将细胞内的电活动用数字的形式表现出来了。随后出现了数字外科等等。提到的这两点是给大家一个启发，在项目的题目上也要下工夫。2、内容要新颖：这是标书的关键，要有自己新的idea。从研究的内容、研究的方法和技术路线上都要体现新，那就需要申报者多动脑筋，多下工夫。二、要“勤”1、勤的第一个方面就是标书要多写，国家级的，省级的都要积极的写。在写的实践过程中不断的提高自己的能力，不要不怕中不了不敢写，也不要因为写了没有中就不写了，只有写了才有机会中，如果不写，是觉得没有机会的。当然这还涉及到一个心理的问题，如果你能完成一份完整的标书，心理上的一个障碍就可能消除。当你再动手开始写的时候你就会说标书我曾经写过，对它的各个步骤不生疏，写起来也就得心应手了，但是这个过程一定要经历。2、勤的第二个方面就是早点准备，在上次申报完以后就开始准备下一年度的题目。要给自己足够的时间来写，来检查标书中存在的问题。修改一年的标书和修改一个月的标书的质量是有很大的差距的。3、勤的第三个方面就是平时要多做些研究工作，对于自己的实验结果要多总结，多发表文章。因为国家自然基金要看你的工作基础，这个工作基础并不只是你现在有基金项目，而更重要的是看你在你自己的研究领域内长期做的工作是否与本次申报的内容有相关性，研究方向和内容上的相关性，实验方法和技术手段上的相关性。如果在这个学科有许多的文章，那中标机会就大大增加了。4、最后就是平时多看杂志、多国家自然科学基金的网站，看大家在研究什么，看往年中了的标书，从别人中了的标书中得到一些启发。5、最后一点，就是关注一些新的信息，上Internet，多查资料，多关心自己学科的最新动态，多写综述，建立工作基础。三、申报内容和研究内容的确定
1、申报内容：国家自然科学基金包括以下几个方面的资金项目：重点项目和重大项目（100-500万元），有子课题和需要项目建议书；杰出青年和海外青年基金（50万元左右，青年的定义为当年的1月1日不满35周岁）；面上项目（20-30万元左右），包括普通项目和青年基金；社科基金（10万元左右）和小项目（5-7万元）。我们应该申请那一部分呢？对于前两部分，中标的可能性太小，就是有实力的科研院所也是很难拿到那样的项目的；所以应该着重在后两个项目上。青年基金只属于35岁以下的，对于这块，大家每年都报的少，但国家投资又大，所以中标率相对要高。2、研究的内容：或叫课题的性质，要正确的定位，基础的要以基础研究研究为主，临床的要以应用基础研究和应用研究为主，公卫的应以基础研究和应用基础研究为主。对我们公卫的来说有一点很重要，就是实验室研究和人群调查想结合，才有可能拿到大的科研项目。单纯是人群调查而没有实验室研究的话，国家自然基金不会支持这方面的课题的。这主要是针对我们预防医学而言的，公卫的许多学科都涉及这个问题，如统计、流病、儿少、环卫、劳卫，涉及到人群调查的，要想办法加上实验研究的内容。当然还有一点，申报公共卫生学科的必须有人群的内容，以后如果没有人群的内容会在初审就被刷下来。四、人员的配置对于自己申报时的合作者，在选择的时候应该注意。注意要有梯队，最好是高级职称、中级职称和初级职称（包括在读研究生）相结合。1、关于高级职称，一方面他不能同时在国家自然科学基金里有两项在研项目，所以选择高级职称作为自己的合作对象，这点一定要注意。两项包括项目主持人和第一合作者。有些申报者在初审时，由于有些高级职称中已经有两项而被刷下，很可惜的。对于高级职称者主要是理论和技术指导，所以不宜过多。2、中级职称，单独申请中标的可能性比较小（需要两位高级职称的推荐，博士学历）。所以高级职称者可以利用他们的有时来和他们合作，一是选择他们成果多的（包括发表文章的数目），对自己的实验梯队和工作组基础是个弥补；二是一般不会冲突，在初审的时候不会象高级职称那样严格，有时候对中级职称的都不审查。五、仪器设备整个教研室的可以用，整个院系的可以用，整个学校的都可以写，都是我们可以利用的资源。不要因为一起设备不过关而不敢写，不要因为仪器设备限制了自己的idea。只要有思路，其他的仪器设备可以通过用自己学校的资源或者和别的单位合作。六、写好标书的一些注意事项1、关于内容书写的一些问题。立题依据要充分，有说服力，引用的参考文献要支持自己的观点最好能有自己的文章引用；参考文献一般是10篇左右，尽可能的新（最好是近3年的），能的话写到本年的9、10月份，自己的关于本课题的文章也不能太多，否则会认为你只是要钱；书写格式要条理清晰，比如说技术路线，最好做出路线图，直接条理，给评委留下好的印象。2、资金预算，对于管理费和能源消耗费有明确的规定，不能超过5%，对于仪器设备是不资助的，所以不能把买仪器设备写进国家自然基金标书的。如果你连小仪器都买，说明没有科研基础，买大仪器，没有那部分钱给你买大仪器的因为国家自然基金的资助原则是⑴把握科学前沿，推动“源头创新”；⑵围绕与我国经济社会发展密切相关的领域，解决可持续发展中层次科学问题；⑶充分利用我国的优势和特色（人力资源，比如队列研究和环境基因组等）；⑷重视开展形成我过的自主知识产权。3、要注意学科间的合作，也就是在成员队伍里最好能有不同学科的人来参与。也就是学科的交叉，容易产生源头的创新，能够出新的成果。4、自查自纠。写完了可以过几天在看看 ，不断修改，不要以为写完了就没有事情了。有时候可能当时没有发现，也可能是自己看了杂志或其他资料后觉需要补充，所以上面也提到了要早点准备。5、要请教一些内行和外行来看。一是看他们能不能理解了你的标书的意思，因为国家自然基金委的评委可能是外行，不是自己本专业的；二是让他们看看有没有创新，值得不值得研究；三是让他们从他们的专业角度和自己的经验来给自己提点意见和建议。可以请一些年轻的教师，因为他们学的东西比较新，另外他们的思维也比较活跃。多听点意见总不是什么坏处吧。6、不要随便丢弃自己没有中标的标书。经过修改和充实以后，第二年还可以再投的，当然也可以投到别的基金项目，如省自然基金、科协的或其他的。7、关于工作基础。上面提到了一些，这里的工作基础，不是说申报者一个人的工作基础，而是指整个科研工作组（人员）和整个学校（设备）。这个一定要重视，可以利用参与者的工作基础和学校的资源来弥补自己本身的不足和缺陷。8、科学术语要规范。不能因为术语的定义让人一下就看出毛病，让人觉得科学不严谨。9、要有耐性。基础研究本来就是持续性和积累性的问题，有人统计，国家自然基金每个人平均7年能中标一次。也就是说，你投7次才有可能中标一次啊。七、那些学科比较好申请一是上面提到的新出现的研究内容，热点内容，二就是一些国家自然基金委重点支持的方向；三是一些国家自然基金委鼓励的项目。国家自然基金优先资助的领域（与生命科学有关的）有：⑴生命科学体系中的化学过程；⑵脑研究；⑶蛋白质组学；⑷生物多样性和可持续的生态系统；⑸我国人口与健康的基础科学问题；⑹中医药现代化的基础科学问题；⑺重大工程灾害及其防治（如SARS等重大的事件，不仅仅是卫生问题，也比如类似于9.11，伊莎贝尔飓风等问题）。鼓励的领域有：⑴传染病和寄生虫；⑵环境、遗传与社会心理因素；⑶主要环境因素对人群健康影响及其群体易感性和预防；⑷膳食结构和食物成分及其食品质量及健康；⑸性传播疾病的流行病学及防治。八、关于关系每年靠关系拿国家自然科学基金的人有，但是那是少数。绝大多数还是靠实力。所以不要因为没有关系而觉得不可能申请到课题。有一点清楚就行了“实力是基础，关系是关键”。没有实力和良好的标书是没有用的。九、格式提纲按提供的格式写，并全部保留。正文字用小四，让人看起来舒服。申报体会二：对于面上项目的一些个人看法：题目要有新意，吸引人，但要容易懂。立论依据很重要，一般提出项目的背景和当前发展状况，其实这里要给评委一个印象，就是不解决这个问题，无论国外还是国内，甚至人类的损失非常巨大，文字可以有适当的弹性。因为文字多，可以把认为重要的句子字体增粗，下面打点以示关键，同时也减少了评审人的麻烦。参考文献要新，最好是当年的。最好能要引上Science、Nature、Annual Reviews系列杂志的近期文献，增加自己立论依据的权威性。研究目标要精、内容要详细但文字不宜过多，需要解决问题要有难度，但不必写的太具体，否则有时会出现mission impossible。研究方法、技术路线、实验方案也不能太具体化，那些有具体实验方案的“实验计划似的”标书，往往容易出漏洞，被给予差评，基本上通不过。研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析其实与目标、内容是相似之处，就是把一个问题讲具体了。技术路线如果能用图表示就体现精而有说服力了，一般可以一页。可行性分析除了对本单位的研究实力进行恰当的分析外（可以有一些超前性），最好找一家比自己单位强的合作伙伴，把他们的软硬件条件也加进去，现在的项目越来越看重多单位合作了。创新点就要靠个人发挥了，越前瞻越好，可以体现近期的成果，更要突出深入和延续研究的必要性。（大家认为这点非常重要）预期结果要考虑对基础和实用双重的价值，如果能够建立一套实物体系那更好了。以发表论文和申请专利结题比较容易。最好突出SCI收录杂志的影响因子，给基金委的专家们觉得，您的实力确实不一般。因为最终结题情况，是基金委专家们最关心的事情，他们当然愿意把基金支持能发表高水平文章的人。他们也好向党和人民交待。我感觉关键还是选题要好，如果有多学科交叉，一般都会比较受人青睐。多学科交叉，极容易申请到基金，尤其是青年基金和小额资助项目。评审可能是本专业的，也可能不是，就算是本专业，可能也不懂你的东西，所以写作很重要，要把复杂的事说简单，要吸引评审的眼球，要让一个不懂你专业的人都觉得你的东西很重要，哪怕不懂也值得去尝试。要把复杂的事说简单，但是还不能让评委完全看懂您的东西。要让他们看过之后，感叹您idea的精妙，却不太明白您的理论依据，只明白您的实现方法。具体原则是：“写出来的理论，有点让别人看不懂”。自然基金的医学部分其实不多，大多的研究经费都给理工专业去了，特别是面上项目，基金委鼓励大家去探索，而不是一定要出个成果，所以思维可以再发散一些，多和非医学专业的联系合作。创造性火化就可能源源不断了。基金申请书写完了，申报的方向和学部也很重要。尽量避重就轻，在竞争不很激烈的领域申请。除非您有充分的把握，认为自己实力确实比竞争对手强很多。注意研读基金申报指南，不要放过细节。每年每个专业领域都有倾斜项目和优先资助方向，这个非常重要！我去年就是按照这个指南，把自己的申请书归到倾斜项目中得到资助的。关于前期工作。前期工作非常重要，但是写基金表的时候，要合理掌握。前期工作，要有已发表的高水平文章，至少1-2篇，申请医学领域的基金，有SCI IF&2的文章或中华医学系列的文章最佳。与课题关系远一些无所谓，但是千万不能风马牛不相及。最好既相关，又不同。对于没有发表过的内容，尤其是与本课题相关的内容，一定要慎重掌握！不要写的太多，容易泄密，以后自己的文章可能不好发表。另外，如果写的太多，评委会说您的工作做的差不多了，没必要再申请基金了。但是没发表过的前期工作又必不可少，这是证明您课题可行性的一个佐证。不可行的工作，谁会去做啊。注意行使基金委赋予的权利，就是那个回避制度。确实在学术界，有极个别的评委、专家在学术道德方面有些问题。我们尽可能利用回避制度，来进行自我保护。项目组成人员应以本单位中级职称为主体，附带1-2名研究生，而不应将研究生列为主要人员。这样基金委会初步认为人员稳定，富有干劲。临床课题研究属性千万别选临床应用，而应该选应用基础。否则基本不能幸免。经费申请表中有两项：仪器设备费，实验室改装费。尽量少填，最好不填。虽然基金委并不明确反对用基金购置仪器设备，但如果有超过万元的仪器设备费，会给人研究条件不过硬的印象，基金委当然希望把钱投到硬件条件好的单位，可以把基金用于刀刃上。面上项目自由申请项目申请经费在22万元左右比较理想，符合基金委资助力度。正文中有一项承担科研项目情况，如果手上还有其他基金项目的，写上后给人感觉科研实力较强，但也容易让基金委有重复投资的顾虑。特别是几个项目相关性较强时，还是不填为好。另外再补充一些：一、标书的重点：摘要及立项依据。1、摘要限400字，因此要特别注意重点突出，防止“头重脚轻”，即与课题相关的一般性描述太多，而对要研究的东西阐述不够。2、观点(推论)一定要明确，非常肯定。3、立项依据中研究意义要争取开门见山，不要说过多相关但无直接联系的话，主要是讲清楚你发现了什么，准备做什么，怎么去做。国内外研究现状不必太多，但除了有最新的权威杂志文章以外，最好加入部分国内相关领域专家的新文章，不必故意回避，而且如果恰好碰上这份专家评审，那就更好了。4、最好包括已有工作基础一节，将已有相关结果以及发表的杂志列上，可以增加可信度。二、研究内容及方案切忌复杂，以免过于凌乱，步骤最好有一流程图。节省评审专家时间。三、可行性分析可包括：理论上可行、有预实验基础、课题组成员力量雄厚、技术成熟、实验设备有保障这几部分。关于人员梯队项目组成员（80分）主要成员6-10名，结构合理高级研究人员（1-2人）中级研究人员（2-3人）技术人员及研究生（3-5人）国家自然科学基金的评审程序标书的评议指标及分值1.
立论依据：420分2.
研究方案：330分3.
研究基础：250分
总分1000分一、立论依据 （420分）1. 课题研究的意义（100分)涉及重要领域的重要问题, 具有重要的理论价值或应用前景2. 科学性：（90分）
研究的背景：国内外目前的研究现状n
存在的问题：提出研究的切入点n
研究设想：研究目标及思路n3. 学术思想及创新性（150分）
理论创新：新学说或理论n
方法创新：新方法n
技术创新：技术改进或完善n4. 对国内外研究现状的了解（80分)
广度和深度：近5年的主要研究进展n研究中存在的主要问题
参考文献：
国外文献 近5年n 数量：20-30二、研究方案（330分）1. 研究内容和拟解决的关键问题（80分）
范围合适：3-5个内容n
重点突出：1-2个重点n
关键问题选择准确：1-2个关键问题n2. 技术路线（90分）
设计合理：基础与临床n
方法可行：成熟可靠 可重复性强 易于掌握n3. 研究方法及手段（90分）
方法先进：n
技术成熟可靠：n
有创新：n4. 研究的预期目标（70分）：明确，可以达到，留有余地。
发表的研究论文：n
申请的技术专利：n
可应用产品的开发：n三、研究基础（250分）1. 与本项目有关的工作积累（90分）
主要研究者的研究背景及经验：n
与本研究相关的前期研究：n
n 已发表的研究论文：2. 已具备的实验条件（80分）
实验室条件：主要仪器和设备n
n 技术条件：实验模型的建立,预实验的结果,关键实验材料
国内及国际合作：合作的背景及技术优势n3. 项目组成员（80分）主要成员6-10名，结构合理
高级研究人员（1-2人）n
中级研究人员（2-3人）n
n 技术人员及研究生（3-5人）四、经费预算
人员费：5 %n
管理费：5 %n
仪器费：《 10%n
n 合作费：《 10％
实验材料费：60-70%(五、专家委员会的意见要对申请人及研究项目进行具体的评价：
( 学术水平：已经取得的成就
科学态度：人品及学风(
项目的重要性：理论意义及实用价值(
( 实验条件：能否满足研究需要六、如何提高中标率1.
精选课题申请人：2.
预审标书并进行修改：3.
优化组合研究队伍：4.
孵化、扶植课题项目：下面是一封可笑的广告信，基金委网站已经做过声明。但是我觉得内容很有可取之处，所以把有用的部分贴出来给大家参考。另外，请注意，千万不要找这些“专家”有偿咨询，有百害而无一利！以下内容，请大家审慎地参考。咨 询 通 知在国家自然科学基金的申请课题中，只有少数项目是选题本身不够新颖，大多数项目是对研究内容、技术路线的阐述不够清楚和填写形式上存在漏洞而未中标。针对以上问题，我们通过对这些年课题评审情况进行深入研究，结合这几年对申请书进行修改的经验，组织在国家自然科学基金委员会工作多年的资深科研管理人员和参加评审的专家教授组成了咨询中心，对您的申请书提出详细、全面的修改意见（主要是与生命科学有关的课题）。咨询内容：1、简表填写是否规范，包括申请金额是否合理、投送学科是否恰当、参加人员技术力量的配备是否合适，等等；2、选题方向是否科学、有创新、有科学意义，立项依据是否充分、清楚而没有漏洞，国内外的参考文献是否全面、准确；3、目标、内容和关键问题的选择是否得当，叙述是否充分而有条理；4、技术路线的设计和实验方案的选择是否先进、科学、合理、可行，描述是否清晰、简练；5、工作基础中，是否将与课题的研究内容相关的研究工作，清楚、透彻、技巧地进行了阐述，使评审者对课题组的前期工作和科研条件有足够的了解和认识；6、经费预算是否合理地按有关规定进行计算；7、成员介绍是否紧扣课题的研究内容和技术路线，既注重梯队、比例、技术力量等科研综合实力的展示，又注意与本课题相关；8、标书是否思路清晰、表达清楚，圆满而无漏洞，尤其是创新性、可行性和工作基础三方面的表述是否层次分明而又紧密结合、前后呼应。
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