细胞剥离和细胞剥离是同一个概念吗？

点击联系发帖人 时间：2022-05-04 10:08
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对于大部分科研人员来说，研究中一般用到均是现成的细胞系/株，我们只需要：进行细胞传代和保种。然而，这些细胞系常常由于体外长期培养，而丢失原有生物学特性，对药物处理的反应差距越来越大。因此，原代细胞的地位日渐凸显，Paper中若有了原代细胞的数据都会添色不少。然而，就小编亲生经历，原代细胞分离着实是个技术活，今天我们就结合自身经验，为大家介绍：肿瘤组织和正常组织的原代细胞的分离与培养方法。

第一部分：原代细胞的基本知识

1. 什么是原代细胞培养?

原代细胞（Primary cells）：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进行培养的细胞。这里的组织主要指：组织器官、外周血及胚胎等。

原代细胞培养：由于原代细胞生长缓慢，繁殖一定的代数停止生长（一般10代以内）。所以一般认为：培养的原代的第1和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。

原代细胞和细胞系的比较：


原代细胞和细胞系的比较

由于原代细胞生物学特性未发生很大改变，最接近和反映体内生长特性，因此是：

(1) 研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的工具；

(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准用药的目的。

第二部分：原代细胞分离和培养技术

将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶/胶原酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。主要包括取材——分离——培养等3部分；

在原代细胞应用较多的包括：组织器官（如实体瘤、皮肤等）、悬浮细胞的取材等。

病人自体的原代肿瘤细胞由于更接近临床患者标本，可以更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准用药的目的。所以对病人自体肿瘤细胞体外分离与培养十分必要。

原代肿瘤细胞的分离步骤

备注：上图细胞为肉瘤患者的原代细胞

1. 在无菌条件下的冰上对新鲜离体的肿瘤组织，剔除包膜及坏死组织，无菌PBS清洗3-5次；切成约1mm3组织块；

3. 离心，并加入胶原酶消化（含蛋白酶）；

4. 消化期间，置于37°培养箱。每15min摇晃一次，消化时间根据肿瘤组织来定，约1-2h；

5. 待大部分组织块消化成透明状时，用 40μm 的细胞滤网过滤细胞，收集；

6. 用培养基重悬，置于培养箱培养。

Q：为什么我取得原代肿瘤组织，分离的却不是肿瘤细胞？

A：取材时，我们要熟悉所需组织的类型和部位特征，选择肿瘤细胞集中、活力较好的部分。避免结缔等正常组织。

Q：若是细胞中混成纤维细胞，如何去除？

A：成纤维细胞的去除对于肿瘤细胞培养十分重要。由于成纤维细胞贴壁速度较肿瘤细胞快，可利用反复贴壁法使二者分离，进而达到清除成纤维细胞的目的。

Q：为什么离心后，没有细胞分离出来？

A：需要考虑消化酶的因素，由于肿瘤组织较致密，胰酶无法消化，一般选用胶原酶，如胶原酶Ⅳ。若是组织十分致密可以再结合机械法，如研磨或者搅拌加速细胞分散。如下表为二者的区别：


注：胶原酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，根据分离的组织类型需选择合适的胶原酶类型。

Q：消化时间如何确定？

A：具体的消化酶的量和消化时间可根据组织类型和多少进行调整。

Q：消化之前为什么用EDTA?

A：EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物后，形成的机械力可使细胞分散。

Q：细胞量太少，长不起来怎么办？

A：有几种办法，如对没消化完的组织块反复消化，尽量多收集一些细胞；并且尽量传代到小皿里，如6孔板都可以。若是细胞仍太少，应耐心等待，尽量不要传代，只换液。

A：尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。为了尽快促进细胞贴壁，可以提前1h将千分之的明胶铺于培养板。

Q：肿瘤原代细胞培养方法与细胞系不同之处在哪里？

A：培养基一般选用RPM1640，DMEM等，建议最好能加入促生长的物质：如胰岛素、氢化可的松、雌激素、EGF等因子。

二、 原代正常组织分离

皮肤是人体最大的器官，但长久以来，表皮细胞一种被认为是难以培养的细胞，限制了皮肤生物学基础研究的发展。作为表皮的主要细胞，角质形成细胞已经成为我们了解皮肤生物学至关重要的许多原创性研究的焦点。

下面就介绍下小鼠角质形成细胞的分离和培养。基本过程如下图：

原代小鼠角质细胞的分离步骤

Q：皮肤组织作为正常组织，与肿瘤组织分离主要区别在哪里？

A：首先，皮肤组织需要用中性分离酶dispaseII将表皮分离出来；其次，在消化时，用的是胰酶，而非胶原酶，并且胰酶的浓度用的是0.05%，而不是0.25%。

Q：表皮的分离需要注意什么？

A：表皮一般可以完整的撕脱下来，温度的变化，孵育的时间以及所用的酶的浓度都会影响表皮是否能完整剥离。

Q：为什么需要无Ca血清来终止消化？

A：因为Ca2+的浓度可以影响角质形成细胞的生长，并且培养时必须严格调控培养基中的Ca2+浓度。

对于悬浮的原代细胞，如腹水或者胸水的癌细胞，可以直接低俗离心，将细胞洗涤几次后置于合适培养基中。若是人为的骨髓或者外周血，则需要淋巴细胞分离液分层后再接种培养。

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嘌呤与嘧啶核苷酸合成过程中共同需要的酶是:

与血液中游离脂肪酸结合的,是血清醋酸纤维薄膜蛋白质电泳实验中的第几条条带?

治疗强心苷中毒所引起的轻度房室传导阻滞或窦性心动过缓,最好选用:

关于金黄色葡萄球菌引起的毒素性疾病,错误的是 ?

正常情况下,B细胞不能把可溶性自身抗原提呈给T细胞而诱导自身免疫应答的原因是?

目前所知机体内抗原提呈功能最强的细胞是 ?

下列哪一种免疫细胞兼有杀伤作用和抗原提呈作用?

下列哪种受体激活后,启动NK细胞的杀伤活性?

如果长期使用免疫抑制剂易出现的不良后果是?

参与TD-Ag刺激机体产生抗体的细胞是?

下列有关IgG的描述,下列哪项是不正确的?

以下不具有紫外线吸收性质的氨基酸是()

下列关于假复层纤毛柱状上皮的描述,错误的是()

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一名刚从海地移民到美国的5岁男童因发热、腹泻、腹部痉挛及压痛而就诊。大便检查为粘液血便,大便培养出革兰阴性杆菌,不发酵乳糖,无鞭毛。最有可能的病原菌是?

一肾脏移植患者,术后一切正常,三个月后出现体温升高。肾移植一侧胀痛,尿量减少,病人可能是?

小明,12岁,患有胰岛素依赖型糖尿病,局部反复多次注射胰岛素后,出现了类Arthus反应,与下列什么有关?

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大三学生林某参加排球比赛,因接球偏离击中右眼至穿通伤,医生为其做了综合治疗。4周后左眼有轻微眼痛、畏光、流泪、视力模糊,刺激症状逐渐加重。请问左眼损伤的诱因是?

老张的儿子马上要结婚了,这两天老张亲自动手给楼道墙面刷了两遍油漆。今天早晨起床后发现左手上有红肿、皮疹和水泡,老王才想起昨天为了干活方便,没带手套。老王的手最有可能患得是?

乐乐,12岁,是一名糖尿病的患者,每天需注射胰岛素控制血糖。多次注射后在注射局部出现了红肿、坏死等类Arthus反应,这与什么有关?

刘女士,27岁,经营网店。一月前起无明显诱因出现面部红斑,无瘙痒及疼痛,伴有全身多关节疼痛及活动受限,四肢皮肤散在红色皮损,局部破溃。经实验室检查,抗核抗体阳性。你初步判断刘女士最可能的疾病是?

王女士,58岁,退休工人。晨起手、足小关节不灵活,多关节对称性、游走性疼痛。诊断为类风湿关节炎。请问其主要发病机制是什么?

人类嗜食辣椒刺激口腔感受器,输入痛觉到中枢神经系统,继而引发分泌脑啡肽压制这种痛觉,从而让人感受到欣快感,这种机制中,脑啡肽扮演的角色是()

李某,慢性末梢神经炎并发浮肿、心力衰竭入院。自述为东南亚华侨,长期食用精米,少吃粗粮,诊断为脚气病。请问你作为主治医生,应当下医嘱令其补充下列哪种维生素()

甲乙丙丁四位患者,均患有肺癌入院,查的四人多胺水平为甲>乙>丙>丁,请问四人中谁的预后最好?

常凯申,男,86岁,因“肝硬化、肝性脑病”入院,查体发现患者神志不清,对呼唤无反应,嗜睡,但是可以唤醒。入院后发生便秘,经灌肠,排出下列肠道腐败作用产物,请问其中哪项可能促进了患者肝性脑病的发展()

李某,因尿路感染入院,给予磺胺治疗。请问,磺胺抑制细菌繁殖的机制为()抑制

李某,女,18岁,发热咽痛鼻出血10天,胸骨压痛明显,右下肢皮肤可触3cm×3cm大小肿块,质硬.红细胞2×109/L,血红蛋白60g/L,白细胞2×109/L,血小板20×109/L,骨髓增生极度活跃,原始细胞80%,部分胞浆中可见Auer小体,POX染色弱阳性,PAS染色胞浆淡红色,醋酸萘酚酯酶染色阳性,能被NaF抑制,诊断是急性单核细胞白血病。请问患者可以用下列哪项药物治疗?

患者,女,14岁,因肺炎需注射青霉素,结果皮试反应呈强阳性,这属于药物的

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葡萄糖在小肠黏膜上皮处的吸收是通过继发性主动转运实现的,抑制下列哪种功能活动可以影响该葡萄糖的吸收

男性患者,29岁,因尿频、尿痛、尿急6个月入院。经静脉肾盂造影检查,右肾盏大部分破坏,左肾正常。尿中结核菌三次均为阳性。诊断为“右肾结核”。治疗:右肾切除术。请考虑与手术入路及周围解剖结构不符的问题是 ( )

某患者,胃溃疡5年,在一次暴饮暴食后突发上腹部剧烈疼痛休克入院,诊断为胃后壁穿孔,胃后壁穿孔后,胃内容物流入( )

白喉是由白喉杆菌引起的急性呼吸道传染病,以咽、喉等处粘膜充血、肿胀并有灰白色伪膜形成为突出临床特征,急性发作时可引起喉腔阻塞,阻断肺通气危及患者生命,必要时喉腔穿刺抢救,请问通常进行穿刺的部位是( )

胚泡的植入部位通常在子宫体或底部,多见于后壁。第12天胚泡植入子宫内膜后,形成一个圆盘状结构,称为:

某患者昏迷不醒,曾有乙肝病史,昏迷前一段时间睾丸萎缩、乳腺发育和蜘蛛痣。则其可能昏迷的原因是

支气管扩症引起肺原性心脏病的原因是由于

引起小儿“冬季腹泻”最常见的病毒是 ?

某幼儿园流行急性甲型肝炎,为扑灭流行,应紧急采取的措施是?

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协助B细胞对抗原进行特异性识别的受体是?

编码产物位于细胞核内、对基因的转录有直接调节作用的癌基因家族是

了解最多且其产物具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌基因家族是

①体内ATP增加时,ATP对磷酸果糖激酶抑制作用属于

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我培养的是3T3成纤维细胞，方法是：
（1）准备大量的3T3细胞，每个安瓿瓶装1－1000000个细胞，然后冻存。使用的细胞不超过20代。
（2）将3T3细胞加入175cm2的培养瓶中，用含有10％小牛血清DMEM培养。案每平方厘米15000个细胞接种。2天后换液，每4－5天传代。
（3）通过60Gy X射线或Co饲养细胞灭活。被照射的3T3细胞在4度条件下可存放3－4天。
（4）在无照射源的条件下，用丝裂菌素C灭活饲养细胞。
（5）在37度条件下，用400微克每毫升的丝裂菌素C处理单层3T3细胞1h。
（6）用胰蛋白酶消化丝裂菌素C处理过的细胞活，混悬细胞，用含有血清的培养液洗细胞2次。然后，用完全培养液混悬细胞调整细胞密度

分离培养大鼠腹腔巨噬细胞

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