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中国人民解放军54960部队医院
医院别名：中国人民解放军54960部队医院
医院性质：公立/综合医院
医院等级：未知
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联系地址：潍坊市鸢飞路871号
问：如何从小鼠的脾脏中提取T 淋巴细胞?越详细越好,最好有每一步的具体操作步骤,谢谢! by hefengfeng2001首页 | 杂志 | 培训 | 继教 | 会员 | 社区 | 护理 | 投稿 | 名企 | 学分 | 文献
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首席医学网 && 杂志 && 《中西医结合学报》 && 2005年 第5期 总第6期(双月刊) &&
枸杞多糖对荷瘤小鼠肿瘤微环境T淋巴细胞亚群及树突状细胞的影响
www.shouxi.net
何彦丽，应逸，许艳丽，苏俊芳，罗惠，王惠峰
11:45:48 《中西医结合学报》 2005年10月 第3卷 第5期
关键词：枸杞多糖
〔摘要〕目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）对荷瘤小鼠体内肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群和树突状细胞（dendritic cells, DCs）的影响，探讨LBP对荷瘤机体免疫逃逸的干预作用。方法：用LBP给H22荷瘤小鼠灌胃，连续2周后，测定肿瘤重量，采用流式细胞术检查肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL）中T淋巴细胞亚群和DCs的数量，以及协同刺激分子CD80（B71）表达的变化。结果：LBP可明显抑制肿瘤细胞的生长，增加肿瘤浸润CD4+、CD8+细胞的数量。LBP高剂量组CD4+和CD8+细胞数量的百分比高于模型组(P&0.05)。LBP低剂量和高剂量组肿瘤浸润DCs数量及B71表达均较模型组升高，但差异无统计学意义。结论：LBP的抗肿瘤作用可能与恢复荷瘤小鼠TIL中CD4+、CD8+的细胞数量、解除机体的免疫抑制状态及增强机体的抗肿瘤免疫功能有关。LBP能否恢复荷瘤机体DCs的表型及功能尚待进一步研究。
〔关键词〕枸杞多糖; 免疫抑制; 淋巴细胞亚群; 肿瘤浸润淋巴细胞; 树突状细胞
Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice
HE YanLi, YING Yi, XU YanLi, SU JunFang, LUO Hui, WANG HuiFeng
(Department of Pathology, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong Province 510405, C Department of Hematology, Guangzhou Municipal First People’s Hospital, Guangzhou, Guangdong Province 510180, China)
Objective: To study the effects of Lycium barbarum polysaccharide (LBP) on tumor microenvironment Tlymphocyte subsets and dendritic cells in H22bearing mice and the mechanisms for intervention of tumor immune escape by LBP. Methods: H22bearing mice were given LBP orally for two weeks. Tlymphocyte subsets and the phenotypes of dendritic cells in tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) were detected by flow cytometry (FCM). Results: LBP could significantly increase the numbers of CD4+ and CD8+ T cells in TIL as compared with those in model control group (P&0.05). In model control group, the number of dendritic cells in tumor microenvironment decreased markedly, while in LBPtreated group, the increased number of dendritic cells and B71 expression were observed, but there were no significant differences between these two groups. Conclusion: LBP has antitumor effect probably by increasing the numbers of CD4+and CD8+ T cells in TIL to relieve the immunosuppression and enhance the antitumor function of the immune system. But whether LBP can recover the phenocyte and function of dendritic cells in H22bearing mice should be further studied.
Lycium bar T tumorinf dendritic cells
近年来的研究发现：肿瘤患者体内存在多种免疫逃逸机制，表现为CD4+和CD8+ T淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值改变及肿瘤间质中的树突状细胞（dendritic cells, DCs）表型异常，这些都是导致恶性肿瘤细胞逃逸机体免疫监视从而造成肿瘤持续生长并发生转移的原因〔1,2〕。已有研究证实：枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide, LBP）具有明显的免疫调节和免疫保护功能，可以增强机体的抗肿瘤作用〔3,4〕。但LBP抗肿瘤的作用机制究竟为何？是否与其影响免疫活性细胞的功能有关？如何从免疫逃逸的角度探讨LBP的抗肿瘤作用机制？有关这方面的研究却鲜见报道。本实验以H22肝癌腹水瘤荷瘤小鼠为模型，研究LBP在全身给药情况下，对肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群及DCs的影响，从免疫逃逸的角度揭示LBP抗肿瘤作用的机制。
1材料与方法
昆明种小鼠，清洁级，6～8周龄，体质量（18±2）g，雌雄各半，广州中医药大学动物中心提供，动物质量合格证号0002769；H22肝癌腹水型细胞株，中山大学医学院动物中心细胞库提供；LBP，由广州中医药大学药物化学研究所自宁夏枸杞子中提取，呈棕黄色粉末，纯度≥35%；Ⅳ型胶原酶和Ⅰ型DNase酶，均为Sigma公司产品；淋巴细胞分离液，广州展晨生物科技有限公司产品；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的抗小鼠CD4、CD80（B71）单克隆抗体，藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的抗小鼠CD8a、CD11c单克隆抗体，美国BioLegend公司产品；电子天平，日本岛津公司产品；FACS Vantage流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品。
1.2实验动物及分组
昆明种小鼠60只，随机分成4组：正常组、模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组，每组15只。其中后3个组，第1天右侧腋下接种2×106个H22肿瘤细胞。第3天起，前2个组小鼠予以生理盐水灌胃，0.5 ml/d；后2个组LBP给药剂量根据文献〔5〕结合预试验结果，分别给予LBP 0.625 g?kg1?d1及1.25 g?kg1?d1灌胃（均用生理盐水稀释成0.5 ml/d），连续灌胃14 d。
1.3LBP体内抑瘤率的测定 每日观察并记录小鼠生长情况及肿瘤大小，第15天小鼠眼球放血后予以脱颈处死，解剖并观察肿瘤大小及重量，计算肿瘤生长抑制率：局部肿瘤的生长抑制率=（模型组平均瘤重－LBP组平均瘤重）/模型组平均瘤重×100%。所有动物均摘取胸腺称重，计算胸腺指数（胸腺指数＝小鼠胸腺质量/体质量）。
1.4肿瘤间质淋巴细胞的分离
肿瘤组织称重后，挑选瘤体质量≥2 g者置于含青霉素和链霉素各500 U/ml、甲硝唑5 μg/ml的RPMI1640培养液中浸泡30 min后，将瘤体剪成1 mm3大小，置于含0.05% Ⅳ型胶原酶、0.003% Ⅰ型DNase酶及10%小牛血清的RPMI1640培养液中，4 ℃磁力搅拌过夜消化，200目消毒铜网过滤洗涤后，1 500 r/min离心15 min，分离获得肿瘤浸润淋巴细胞（tumorinfiltrating lymphocyte, TIL），用DHanks液洗涤2次，台盼蓝染色检测细胞活力，调整细胞浓度至1×106/ml。
1.5TIL中CD4、CD8a、CD11c、CD80流式细胞仪分析
每个样本分3管，每管中加入3×105个细胞，PBS液调整总体积为100 μl，其中第1管中加入不同荧光素标记的抗鼠CD4、CD8a单克隆抗体0.5 μl（0.25 μg）、1.0 μl（0.2 μg），第2管中加入不同荧光素标记的抗鼠CD11c、CD80单克隆抗体1.0 μl（0.2 μg）、1.0 μl（0.5 μg），第3管为空白对照管，室温避光孵育30 min，PBS液洗涤2次，每次实验取2管细胞分别加入FITC和PE单荧光素标记抗体，用流式细胞仪检测。
1.6统计学方法
所有实验数据均采用SPSS 11.5软件进行统计学分析，行单因素方差分析及组间比较最小显著差(least significant difference, LSD)法。
2.1LBP对H22荷瘤小鼠肿瘤生长及胸腺指数的影响
模型组平均瘤体质量（2.48±0.40）g，LBP低剂量组和高剂量组分别为（1.89±0.29）g和（1.46±0.26）g，其中，LBP高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义（P&0.05）。LBP低剂量组和高剂量组的肿瘤生长抑制率分别为23.79%和41.12%。模型组荷瘤小鼠的胸腺质量较正常组轻，LBP组荷瘤小鼠的胸腺质量及胸腺指数则有所恢复。见表1。
LBP对H22荷瘤小鼠胸腺指数的影响（略）
Effect of LBP on thymus index in H22bearing mice
*P&0.05, vs model control group
2.2LBP对H22荷瘤小鼠TIL中T淋巴细胞亚群的影响
模型组肿瘤间质浸润CD4+、CD8+ T淋巴细胞的百分比分别为（12.89±1.05）%和（7.72±0.48）%。LBP组CD4+和CD8+细胞的百分比较模型组均有明显升高，其中LBP低剂量组CD8+与模型组比较差异有统计学意义（P&0.05），LBP高剂量组CD4+、CD8+与模型组比较差异均有统计学意义（P&0.05）。见表2。
2.3LBP对H22荷瘤小鼠TIL中DCs的影响
模型组TIL中CD11c+百分比为（23.07±2.36）%，CD80+为（15.15±1.47）%，双阳性细胞仅为（11.65±1.73）%；LBP组CD11c+、CD80+及双阳性细胞的百分比较模型组均略有升高，与CD4+、CD8+细胞百分比的升高变化有一定的平行关系，但模型组、LBP低剂量组和LBP高剂量组这三者之间的比较差异无统计学意义。见表2。
LBP对H22荷瘤小鼠TIL中T淋巴细胞亚群及DCs的影响（略）
Effect of LBP on Tlymphocyte subsets and phenotypes of dendritic cells in TIL
*P&0.05, vs model control group
已有研究证实：LBP具有广泛的免疫调节作用，可以增强机体的抗肿瘤效应〔3,4〕。本实验发现：LBP能明显抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长，与文献报道一致，LBP高剂量组肿瘤生长抑制率为41.12%，与模型组比较差异有统计学意义（P&0.05）；LBP还可提高荷瘤小鼠的胸腺质量及胸腺指数，对胸腺具有一定的保护作用。
机体的抗肿瘤免疫主要依靠T淋巴细胞介导的细胞免疫。成熟的T淋巴细胞分为CD4+和CD8+ T淋巴细胞两个亚群。一般认为：CD4+ T淋巴细胞产生大量的细胞因子，CD8+ T淋巴细胞在CD4+ T淋巴细胞的辅助及细胞因子的作用下可以杀伤肿瘤细胞，初次的抗肿瘤免疫反应主要依赖CD8+ T淋巴细胞和自然杀伤细胞的参与。肿瘤特异性的CD4+ T淋巴细胞对肿瘤细胞也具有直接的杀伤作用〔6〕。缺乏CD4+和CD8+ T淋巴细胞，以及CD4+/CD8+比值的降低是导致抗肿瘤免疫效应低下的原因之一。一些研究还发现：LBP是一种有效的免疫增强剂，对免疫系统具有正向的调节作用。刘彦平等〔7〕用BALB/c小鼠做体内研究发现：LBP能增加小鼠脾脏总的T淋巴细胞、辅助性T淋巴细胞（helper T cell, Th）及抑制性T淋巴细胞（suppressor T cell, Ts）的数量，使Th和Ts亚群的比例恢复正常。有研究报道：食管癌组织中的TIL经白细胞介素2、白细胞介素4联合中药黄芪、干地黄水提取物行体外诱导后，CD3+、CD4+细胞比例及CD4+/CD8+的比值均明显上升〔8〕。本实验通过流式细胞术检测发现：模型组TIL中的T淋巴细胞数量明显减少，表明肿瘤微环境中T淋巴细胞的抗肿瘤免疫活力低下，而LBP组的CD4+、CD8+ T淋巴细胞则恢复明显，CD4+在LBP高剂量组，CD8+在LBP低、高剂量组与模型组之间的比较差异均有统计学意义，说明LBP可促进TIL中CD4+、CD8+ T淋巴细胞的增殖与活化，直接杀伤肿瘤细胞，或通过其分泌的细胞因子辅助杀伤肿瘤细胞，一定程度地解除荷瘤机体的免疫抑制状态，从而产生抗肿瘤的效应。
DCs是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，在抗肿瘤免疫应答中起着不可替代的作用，多数证据表明，荷瘤机体免疫机制的失能不是由于缺乏肿瘤抗原，而是由于DCs的功能缺陷导致这些抗原不能被有效地提呈给T淋巴细胞，从而不能诱导细胞毒性T淋巴细胞产生有效而特异性的免疫应答。有多种原因可导致荷瘤机体DCs表型的改变，是引起抗肿瘤免疫功能减弱的直接原因。Chaux等〔9〕研究发现：癌旁组织浸润的炎性细胞中主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原分子高表达，而其B71（CD80）和B72（CD86）等共刺激分子则无表达或低表达；丘少鹏等〔10〕对前列腺癌肿瘤微环境中DCs细胞与T淋巴细胞之间免疫关系的研究发现：肿瘤间质中DCs占（20.89±6.06）%，明显低于癌旁组织中的（43.11±6.13）%，且与T淋巴细胞的分布显著相关，故认为癌组织中DCs数量的减少可能与前列腺癌肿瘤微环境T淋巴细胞抗肿瘤的免疫功能低下有关。LBP在体内外可促进多种细胞因子的分泌〔11〕，如白细胞介素2、白细胞介素3、白细胞介素6以及肿瘤坏死因子等，这些因子均能刺激DCs增殖及表型成熟〔12〕。CD11c强烈表达于DCs，通常采用B71、B72分子及主要组织相容性复合体Ⅱ类抗原分子等单克隆抗体检测DCs细胞表型及成熟程度〔13,14〕。本实验发现：模型组肿瘤间质中浸润的单个核细胞CD11c+的百分比为（23.07±2.36）%、CD80+为（15.15±1.47）%，而双阳性细胞只占（11.65±1.73）%，说明成熟、有功能的DCs细胞数量较低；LBP低、高剂量组CD11c+、CD80+及双阳性细胞的百分比均有所上升，与T淋巴细胞亚群的变化有一定的平行关系，但各组间的比较无统计学意义。本实验还发现：LBP可以增加肿瘤间质中CD4+、CD8+ T淋巴细胞的数量，LBP是否可通过使DCs前体细胞增殖并诱导分化为成熟的DCs而使其具有正常的抗原提呈能力，进而激活T淋巴细胞，从而发挥抗肿瘤的作用？上述问题值得进一步研究。
因流式细胞仪的检测有一定的细胞数量要求，细胞数低于105以下时数据的准确性下降，而肿瘤间质中淋巴细胞的分离操作步骤繁琐，又有多次的洗涤过程，因此可能造成较多细胞的损伤与丢失，当肿瘤组织块太小时，更容易导致检测失败，所以只将肿瘤重量≥2 g者纳入检测范围，但这样就造成肿瘤体积明显减少的一部分LBP组的样本未纳入检测范围，从而可能导致结果的偏差。而LBP的抗肿瘤作用是否与其增加DCs的数量及促进其成熟有关，尚待进一步的研究。
〔参考文献〕
1黄羽, 梅玉屏, 曾星. 肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群及天然杀伤细胞活性的检测――附121例报告〔J〕. 新医学, ): 337338.
2何彦丽, 苏俊芳. 中药多糖抗肿瘤免疫药理研究的新思路――对树突状细胞的影响〔J〕. 中国中西医结合杂志, ): 7376.
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4甘璐, 张声华. 枸杞多糖的抗肿瘤活性和对免疫功能的影响〔J〕. 营养学报, ): 200202.
5黎雪如, 戴寿芝, 王慕娣. 枸杞对免疫功能影响的探讨〔J〕. 中华微生物学和免疫学杂志, ): 395.
6黄辉, 俞红, 林云璐. CD4+ T细胞的抗瘤作用〔J〕. 国外医学?免疫学分册, ): 5153.
7刘彦平, 毛辉青, 李萍, 等. 枸杞多糖对小鼠T淋巴细胞亚群和淋巴细胞转化作用的研究〔J〕. 青海医学院学报, ): 48.
8任德莲, 严鹏科, 钟德生, 等. 食管癌肿瘤浸润淋巴细胞体外增殖和表型变化的研究〔J〕. 泸洲医学院学报, ): 375378.
9Chaux P, Moutet M, Faivre J, et al. Inflammatory cells infiltrating human colorectal carcinoma express HLA class 2 but not B71 and B72 costimulatory molecules of the Tcell activation〔J〕. Lab Invest, ): 975982.
10丘少鹏, 陈辉熔, 邓春华, 等. 前列腺癌肿瘤微环境树突状细胞与T细胞免疫的关系〔J〕. 中山医科大学学报, ): 127131.
11吴肖叶, 徐亚利. 枸杞在肿瘤治疗中的作用概述〔J〕. 实用中医药杂志, ): 4346.
12Chen B, Shi Y, Smith JD, et al. The role of tumor necrosis factor alpha in modulating the quantity of peripheral bloodderived, cytokinedriven human dendritic cells and its role in enhancing the quality of dendritic cell function in presenting soluble antigens to CD4+ T cells in vitro〔J〕. Blood, ): .
13王正昕, 曹雪涛, 张明徽, 等. 人肿瘤浸润性树突状细胞的表型分析及原因探讨〔J〕. 中国免疫学杂志. ): 509511.
14程晓明, 王长征, 李淑平, 等. 小鼠脾脏树突状细胞的分离培养及鉴定〔J〕. 第三军医大学学报, ): .
〔本文编辑〕黄文华
〔基金项目〕广东省中医药管理局资助项目（No. 101054）
（广州中医药大学病理学教研室，广东 广州 510405; 广州市第一人民医院血液科，广东 广州 510180）
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“消胖美”注册商标(惠民) 荣获全军科技成果奖的消胖美糖衣片,为广大肥胖患者带来福音。它能使青少年身材苗条匀称,为中老年肥胖解除行动不便而引起的高血压、冠心病、糖尿病等系列合并症的痛苦,通过患者临床验证和技术鉴定,普遍认为减肥效果良好,尤其是对单纯性肥胖、高血压、高血脂患者特别显著,无任何副作用已经卫准字(号批准畅销国际市场〔按说明书服用一个疗程无效者,可酌情退款。为方便用户、办理邮购业务,每4瓶 (100片/瓶)为一包装起邮共售价31元‘治疗近视眼新药一高效近视灵 本品根据老中医长期临床应用验方,由18种中药材科学配方研制而成。具有养心安神、活血疏肝、解郁、开弯、明目功能,经几大医院240例患者临床观察,治疗假性近视效果较佳,每例患者连续服用2盒后.视力可恢复到最佳状态,无任何副作用,实为治疗近视之良药。本品经省卫生厅批准生产(冀卫药准字(84) 1069号)。医药总公司授予优秀产品奖,并荣获国家新产品金鹿...&
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在绵延４０００多里的青藏公路沿线，提及解放军第２２医院，不论部队官兵还是地方百姓，可谓家喻户晓。１９５５年春，陈毅副总理率领庞大的中央代表团赴西藏参加自治区筹委会成立大会。当车队经过刚通车的青藏公路时，严重的高原反应击倒了不少人，年轻的女文工团员马宝燕竟被高原症夺去了生命。陈老总对随行的军队领导人说：“这个地方的病蛮凶的，要赶紧放个部队医院来！”不久，兰州军区第二门诊部奉命从西安来到昆仑山下的格尔木，在戈壁滩上扎下了几顶帐篷———这便是２２医院的“童年”。至今，２２医院已在青藏高原奋战了４７个年头，一直担负着东起青海日月山、西至柴达木盆地的冷湖镇、北抵甘肃敦煌、南到西藏拉萨的２４５７公里驻军的卫勤保障任务，同时也成为青藏公路沿线各族人民的生命守护神。青藏高原环境艰苦，气候恶劣，大风常常会在半夜把帐篷刮走，夏天降雪是常事。２２医院驻地格尔木海拔２８００多米，不算太高，但他们常常要派出医疗队到海拔５０００米左右的唐古拉山、昆仑山、风...&
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济南军区建立“三防”医学应急救援网络本刊讯高伟报道:为了提高各级卫生机构应付突发事件的卫勤保障能力,济南军区联勤部卫生部于近日在全区建立了“三防”医学应急救援网络。军区和联勤各分部、总医院、青岛一疗、军事医学研究所分别成立了一、二级“‘三防’医学应急救援工作领导小组”,军区设立了办公室,其余单位设有值班电话。同时,明确了分工,配备了必需的“三防”卫生装备和药品,组织开展了应急救援演练,使有关人员熟练掌握了应急救援的组织程序和专业技术;建立健全了应急救援预案,确保遇有紧急情况能够拉得出、防得稳、救得下、治得好;强调了请示报告制度,对重大问题或事件须及时请示报告,凡因报告不及时或隐情不报造成严重后果的,将予以通报批评,并追究有关单位领导和当事人的责任。本刊讯陈喜军、史锋庆报道:前不久,在解放军第三医院通报的立功受奖名单中,在该院打工的46名合同制护士榜上有名,在当地引起了不小的反响。这些不穿军装的合同制护士,刚来部队医院打工时,大多...&
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军人伤亡和医疗保险是怎么回事?律师同志: 我是一名士官,最近因肠道肿瘤在部队医院做了手术。有些特殊药是部队领导和我个人出钱买的。我感到很不理解,明明部队每个月都从我的工资里扣除医疗保险费,为什么吃药还要个人花钱?另外,部队每个月还从我的工资中扣除伤亡保险费。请问这两种保险是怎么回事? ——某部谢冰谢冰同志: 军人保险是国家社会保险在军队的具体化体现。它与军人抚恤优待、退役安置等共同构成了具有中国特色的军人社会保障体系。到目前为止,我军已经实行了军人伤亡保险和军人退役医疗保险。 所谓军人伤亡保险,是指通过设立军人伤亡保险基金,对因战、因公伤亡的军人以及因病致残的义务兵给予经济补偿。此基金由国家和个人共同筹集,其中,现役军官、文职干部和士官每人每月按不超过全军军人月平均工资收入的1%缴纳保险费。现在每人每月缴纳5元保险费。义务兵和供给制学员不缴纳保险费。军人因战、因公伤亡或义务兵因病致残后,在享受军人抚恤的基础上还可享受5000元至...&
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一天不见兵,一天不和 战士们聊一聊,总感到心里空落落的。这是张忠顺多年来养成的习惯。作为该部的政委,他每天必到基层营连看一看,转一转。 一个凤和日丽的星期天,张忠顺又早早地来到离营区较远的一个执勤点和大家一起过周末。 “目前,我国人均寿命是多少?”在和大家的交心恳谈会上,张忠顺首先开了腔。“这和站岗有什么联系?”在场的官兵们甚感不解,但见张忠顺真是与大家“平起平坐”搞交心,回答得踊跃起来‘ 勺1岁。”心直口快的北京籍战士任全有第一个举手回答。 一不对,是72岁。”“是73岁。”“是74岁。”……大家众说纷纭,莫衷一是。_见把大家的话匣子打开了,张忠JlW突然话锋一转:“据第六次全国人口普查最新统计,全国人均寿命是73岁。我们一辈子只有2年在为别人站岗,却有71年是别人在为自己站岗。即使按照排长8年的最低服役年限,也有65年的时向是别人在为自己站岗‘”见张忠顺这么一说,大家才真正明白算这笔时间账原来是“醉翁之意不在酒”啊! 接下来...&
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