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(分享)国家自然基金标书申报体会
申报体会一：一、要抓住一个“新”字1、题目要新颖：题目是很关键的东西，要从题目上吸引人，从题目上体现出你研究的“新”来。（1）现在的研究热点。前五年，只要涉及到纳米技术的，国家自然科学基金委全部给予资助，或多或少。分析原因有二：一是这是新出现的，我们国内还是空白，需要从各个方面来加强；二是这方面的标书少，中标率高。（2）别人可能没有听过的名词。2001年吧，有个学者的标书是“数字细胞”，一下就把人吸引住了，最后这个课题拿了一百多万；其实就是用仪器记录细胞信号，将细胞内的电活动用数字的形式表现出来了。随后出现了数字外科等等。提到的这两点是给大家一个启发，在项目的题目上也要下工夫。2、内容要新颖：这是标书的关键，要有自己新的idea。从研究的内容、研究的方法和技术路线上都要体现新，那就需要申报者多动脑筋，多下工夫。二、要“勤”1、勤的第一个方面就是标书要多写，国家级的，省级的都要积极的写。在写的实践过程中不断的提高自己的能力，不要不怕中不了不敢写，也不要因为写了没有中就不写了，只有写了才有机会中，如果不写，是觉得没有机会的。当然这还涉及到一个心理的问题，如果你能完成一份完整的标书，心理上的一个障碍就可能消除。当你再动手开始写的时候你就会说标书我曾经写过，对它的各个步骤不生疏，写起来也就得心应手了，但是这个过程一定要经历。2、勤的第二个方面就是早点准备，在上次申报完以后就开始准备下一年度的题目。要给自己足够的时间来写，来检查标书中存在的问题。修改一年的标书和修改一个月的标书的质量是有很大的差距的。3、勤的第三个方面就是平时要多做些研究工作，对于自己的实验结果要多总结，多发表文章。因为国家自然基金要看你的工作基础，这个工作基础并不只是你现在有基金项目，而更重要的是看你在你自己的研究领域内长期做的工作是否与本次申报的内容有相关性，研究方向和内容上的相关性，实验方法和技术手段上的相关性。如果在这个学科有许多的文章，那中标机会就大大增加了。4、最后就是平时多看杂志、多国家自然科学基金的网站，看大家在研究什么，看往年中了的标书，从别人中了的标书中得到一些启发。5、最后一点，就是关注一些新的信息，上Internet，多查资料，多关心自己学科的最新动态，多写综述，建立工作基础。三、申报内容和研究内容的确定
1、申报内容：国家自然科学基金包括以下几个方面的资金项目：重点项目和重大项目（100-500万元），有子课题和需要项目建议书；杰出青年和海外青年基金（50万元左右，青年的定义为当年的1月1日不满35周岁）；面上项目（20-30万元左右），包括普通项目和青年基金；社科基金（10万元左右）和小项目（5-7万元）。我们应该申请那一部分呢？对于前两部分，中标的可能性太小，就是有实力的科研院所也是很难拿到那样的项目的；所以应该着重在后两个项目上。青年基金只属于35岁以下的，对于这块，大家每年都报的少，但国家投资又大，所以中标率相对要高。2、研究的内容：或叫课题的性质，要正确的定位，基础的要以基础研究研究为主，临床的要以应用基础研究和应用研究为主，公卫的应以基础研究和应用基础研究为主。对我们公卫的来说有一点很重要，就是实验室研究和人群调查想结合，才有可能拿到大的科研项目。单纯是人群调查而没有实验室研究的话，国家自然基金不会支持这方面的课题的。这主要是针对我们预防医学而言的，公卫的许多学科都涉及这个问题，如统计、流病、儿少、环卫、劳卫，涉及到人群调查的，要想办法加上实验研究的内容。当然还有一点，申报公共卫生学科的必须有人群的内容，以后如果没有人群的内容会在初审就被刷下来。四、人员的配置对于自己申报时的合作者，在选择的时候应该注意。注意要有梯队，最好是高级职称、中级职称和初级职称（包括在读研究生）相结合。1、关于高级职称，一方面他不能同时在国家自然科学基金里有两项在研项目，所以选择高级职称作为自己的合作对象，这点一定要注意。两项包括项目主持人和第一合作者。有些申报者在初审时，由于有些高级职称中已经有两项而被刷下，很可惜的。对于高级职称者主要是理论和技术指导，所以不宜过多。2、中级职称，单独申请中标的可能性比较小（需要两位高级职称的推荐，博士学历）。所以高级职称者可以利用他们的有时来和他们合作，一是选择他们成果多的（包括发表文章的数目），对自己的实验梯队和工作组基础是个弥补；二是一般不会冲突，在初审的时候不会象高级职称那样严格，有时候对中级职称的都不审查。五、仪器设备整个教研室的可以用，整个院系的可以用，整个学校的都可以写，都是我们可以利用的资源。不要因为一起设备不过关而不敢写，不要因为仪器设备限制了自己的idea。只要有思路，其他的仪器设备可以通过用自己学校的资源或者和别的单位合作。六、写好标书的一些注意事项1、关于内容书写的一些问题。立题依据要充分，有说服力，引用的参考文献要支持自己的观点最好能有自己的文章引用；参考文献一般是10篇左右，尽可能的新（最好是近3年的），能的话写到本年的9、10月份，自己的关于本课题的文章也不能太多，否则会认为你只是要钱；书写格式要条理清晰，比如说技术路线，最好做出路线图，直接条理，给评委留下好的印象。2、资金预算，对于管理费和能源消耗费有明确的规定，不能超过5%，对于仪器设备是不资助的，所以不能把买仪器设备写进国家自然基金标书的。如果你连小仪器都买，说明没有科研基础，买大仪器，没有那部分钱给你买大仪器的因为国家自然基金的资助原则是⑴把握科学前沿，推动“源头创新”；⑵围绕与我国经济社会发展密切相关的领域，解决可持续发展中层次科学问题；⑶充分利用我国的优势和特色（人力资源，比如队列研究和环境基因组等）；⑷重视开展形成我过的自主知识产权。3、要注意学科间的合作，也就是在成员队伍里最好能有不同学科的人来参与。也就是学科的交叉，容易产生源头的创新，能够出新的成果。4、自查自纠。写完了可以过几天在看看 ，不断修改，不要以为写完了就没有事情了。有时候可能当时没有发现，也可能是自己看了杂志或其他资料后觉需要补充，所以上面也提到了要早点准备。5、要请教一些内行和外行来看。一是看他们能不能理解了你的标书的意思，因为国家自然基金委的评委可能是外行，不是自己本专业的；二是让他们看看有没有创新，值得不值得研究；三是让他们从他们的专业角度和自己的经验来给自己提点意见和建议。可以请一些年轻的教师，因为他们学的东西比较新，另外他们的思维也比较活跃。多听点意见总不是什么坏处吧。6、不要随便丢弃自己没有中标的标书。经过修改和充实以后，第二年还可以再投的，当然也可以投到别的基金项目，如省自然基金、科协的或其他的。7、关于工作基础。上面提到了一些，这里的工作基础，不是说申报者一个人的工作基础，而是指整个科研工作组（人员）和整个学校（设备）。这个一定要重视，可以利用参与者的工作基础和学校的资源来弥补自己本身的不足和缺陷。8、科学术语要规范。不能因为术语的定义让人一下就看出毛病，让人觉得科学不严谨。9、要有耐性。基础研究本来就是持续性和积累性的问题，有人统计，国家自然基金每个人平均7年能中标一次。也就是说，你投7次才有可能中标一次啊。七、那些学科比较好申请一是上面提到的新出现的研究内容，热点内容，二就是一些国家自然基金委重点支持的方向；三是一些国家自然基金委鼓励的项目。国家自然基金优先资助的领域（与生命科学有关的）有：⑴生命科学体系中的化学过程；⑵脑研究；⑶蛋白质组学；⑷生物多样性和可持续的生态系统；⑸我国人口与健康的基础科学问题；⑹中医药现代化的基础科学问题；⑺重大工程灾害及其防治（如SARS等重大的事件，不仅仅是卫生问题，也比如类似于9.11，伊莎贝尔飓风等问题）。鼓励的领域有：⑴传染病和寄生虫；⑵环境、遗传与社会心理因素；⑶主要环境因素对人群健康影响及其群体易感性和预防；⑷膳食结构和食物成分及其食品质量及健康；⑸性传播疾病的流行病学及防治。八、关于关系每年靠关系拿国家自然科学基金的人有，但是那是少数。绝大多数还是靠实力。所以不要因为没有关系而觉得不可能申请到课题。有一点清楚就行了“实力是基础，关系是关键”。没有实力和良好的标书是没有用的。九、格式提纲按提供的格式写，并全部保留。正文字用小四，让人看起来舒服。申报体会二：对于面上项目的一些个人看法：题目要有新意，吸引人，但要容易懂。立论依据很重要，一般提出项目的背景和当前发展状况，其实这里要给评委一个印象，就是不解决这个问题，无论国外还是国内，甚至人类的损失非常巨大，文字可以有适当的弹性。因为文字多，可以把认为重要的句子字体增粗，下面打点以示关键，同时也减少了评审人的麻烦。参考文献要新，最好是当年的。最好能要引上Science、Nature、Annual Reviews系列杂志的近期文献，增加自己立论依据的权威性。研究目标要精、内容要详细但文字不宜过多，需要解决问题要有难度，但不必写的太具体，否则有时会出现mission impossible。研究方法、技术路线、实验方案也不能太具体化，那些有具体实验方案的“实验计划似的”标书，往往容易出漏洞，被给予差评，基本上通不过。研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析其实与目标、内容是相似之处，就是把一个问题讲具体了。技术路线如果能用图表示就体现精而有说服力了，一般可以一页。可行性分析除了对本单位的研究实力进行恰当的分析外（可以有一些超前性），最好找一家比自己单位强的合作伙伴，把他们的软硬件条件也加进去，现在的项目越来越看重多单位合作了。创新点就要靠个人发挥了，越前瞻越好，可以体现近期的成果，更要突出深入和延续研究的必要性。（大家认为这点非常重要）预期结果要考虑对基础和实用双重的价值，如果能够建立一套实物体系那更好了。以发表论文和申请专利结题比较容易。最好突出SCI收录杂志的影响因子，给基金委的专家们觉得，您的实力确实不一般。因为最终结题情况，是基金委专家们最关心的事情，他们当然愿意把基金支持能发表高水平文章的人。他们也好向党和人民交待。我感觉关键还是选题要好，如果有多学科交叉，一般都会比较受人青睐。多学科交叉，极容易申请到基金，尤其是青年基金和小额资助项目。评审可能是本专业的，也可能不是，就算是本专业，可能也不懂你的东西，所以写作很重要，要把复杂的事说简单，要吸引评审的眼球，要让一个不懂你专业的人都觉得你的东西很重要，哪怕不懂也值得去尝试。要把复杂的事说简单，但是还不能让评委完全看懂您的东西。要让他们看过之后，感叹您idea的精妙，却不太明白您的理论依据，只明白您的实现方法。具体原则是：“写出来的理论，有点让别人看不懂”。自然基金的医学部分其实不多，大多的研究经费都给理工专业去了，特别是面上项目，基金委鼓励大家去探索，而不是一定要出个成果，所以思维可以再发散一些，多和非医学专业的联系合作。创造性火化就可能源源不断了。基金申请书写完了，申报的方向和学部也很重要。尽量避重就轻，在竞争不很激烈的领域申请。除非您有充分的把握，认为自己实力确实比竞争对手强很多。注意研读基金申报指南，不要放过细节。每年每个专业领域都有倾斜项目和优先资助方向，这个非常重要！我去年就是按照这个指南，把自己的申请书归到倾斜项目中得到资助的。关于前期工作。前期工作非常重要，但是写基金表的时候，要合理掌握。前期工作，要有已发表的高水平文章，至少1-2篇，申请医学领域的基金，有SCI IF&2的文章或中华医学系列的文章最佳。与课题关系远一些无所谓，但是千万不能风马牛不相及。最好既相关，又不同。对于没有发表过的内容，尤其是与本课题相关的内容，一定要慎重掌握！不要写的太多，容易泄密，以后自己的文章可能不好发表。另外，如果写的太多，评委会说您的工作做的差不多了，没必要再申请基金了。但是没发表过的前期工作又必不可少，这是证明您课题可行性的一个佐证。不可行的工作，谁会去做啊。注意行使基金委赋予的权利，就是那个回避制度。确实在学术界，有极个别的评委、专家在学术道德方面有些问题。我们尽可能利用回避制度，来进行自我保护。项目组成人员应以本单位中级职称为主体，附带1-2名研究生，而不应将研究生列为主要人员。这样基金委会初步认为人员稳定，富有干劲。临床课题研究属性千万别选临床应用，而应该选应用基础。否则基本不能幸免。经费申请表中有两项：仪器设备费，实验室改装费。尽量少填，最好不填。虽然基金委并不明确反对用基金购置仪器设备，但如果有超过万元的仪器设备费，会给人研究条件不过硬的印象，基金委当然希望把钱投到硬件条件好的单位，可以把基金用于刀刃上。面上项目自由申请项目申请经费在22万元左右比较理想，符合基金委资助力度。正文中有一项承担科研项目情况，如果手上还有其他基金项目的，写上后给人感觉科研实力较强，但也容易让基金委有重复投资的顾虑。特别是几个项目相关性较强时，还是不填为好。另外再补充一些：一、标书的重点：摘要及立项依据。1、摘要限400字，因此要特别注意重点突出，防止“头重脚轻”，即与课题相关的一般性描述太多，而对要研究的东西阐述不够。2、观点(推论)一定要明确，非常肯定。3、立项依据中研究意义要争取开门见山，不要说过多相关但无直接联系的话，主要是讲清楚你发现了什么，准备做什么，怎么去做。国内外研究现状不必太多，但除了有最新的权威杂志文章以外，最好加入部分国内相关领域专家的新文章，不必故意回避，而且如果恰好碰上这份专家评审，那就更好了。4、最好包括已有工作基础一节，将已有相关结果以及发表的杂志列上，可以增加可信度。二、研究内容及方案切忌复杂，以免过于凌乱，步骤最好有一流程图。节省评审专家时间。三、可行性分析可包括：理论上可行、有预实验基础、课题组成员力量雄厚、技术成熟、实验设备有保障这几部分。关于人员梯队项目组成员（80分）主要成员6-10名，结构合理高级研究人员（1-2人）中级研究人员（2-3人）技术人员及研究生（3-5人）国家自然科学基金的评审程序标书的评议指标及分值1.
立论依据：420分2.
研究方案：330分3.
研究基础：250分
总分1000分一、立论依据 （420分）1. 课题研究的意义（100分)涉及重要领域的重要问题, 具有重要的理论价值或应用前景2. 科学性：（90分）
研究的背景：国内外目前的研究现状n
存在的问题：提出研究的切入点n
研究设想：研究目标及思路n3. 学术思想及创新性（150分）
理论创新：新学说或理论n
方法创新：新方法n
技术创新：技术改进或完善n4. 对国内外研究现状的了解（80分)
广度和深度：近5年的主要研究进展n研究中存在的主要问题
参考文献：
国外文献 近5年n 数量：20-30二、研究方案（330分）1. 研究内容和拟解决的关键问题（80分）
范围合适：3-5个内容n
重点突出：1-2个重点n
关键问题选择准确：1-2个关键问题n2. 技术路线（90分）
设计合理：基础与临床n
方法可行：成熟可靠 可重复性强 易于掌握n3. 研究方法及手段（90分）
方法先进：n
技术成熟可靠：n
有创新：n4. 研究的预期目标（70分）：明确，可以达到，留有余地。
发表的研究论文：n
申请的技术专利：n
可应用产品的开发：n三、研究基础（250分）1. 与本项目有关的工作积累（90分）
主要研究者的研究背景及经验：n
与本研究相关的前期研究：n
n 已发表的研究论文：2. 已具备的实验条件（80分）
实验室条件：主要仪器和设备n
n 技术条件：实验模型的建立,预实验的结果,关键实验材料
国内及国际合作：合作的背景及技术优势n3. 项目组成员（80分）主要成员6-10名，结构合理
高级研究人员（1-2人）n
中级研究人员（2-3人）n
n 技术人员及研究生（3-5人）四、经费预算
人员费：5 %n
管理费：5 %n
仪器费：《 10%n
n 合作费：《 10％
实验材料费：60-70%(五、专家委员会的意见要对申请人及研究项目进行具体的评价：
( 学术水平：已经取得的成就
科学态度：人品及学风(
项目的重要性：理论意义及实用价值(
( 实验条件：能否满足研究需要六、如何提高中标率1.
精选课题申请人：2.
预审标书并进行修改：3.
优化组合研究队伍：4.
孵化、扶植课题项目：下面是一封可笑的广告信，基金委网站已经做过声明。但是我觉得内容很有可取之处，所以把有用的部分贴出来给大家参考。另外，请注意，千万不要找这些“专家”有偿咨询，有百害而无一利！以下内容，请大家审慎地参考。咨 询 通 知在国家自然科学基金的申请课题中，只有少数项目是选题本身不够新颖，大多数项目是对研究内容、技术路线的阐述不够清楚和填写形式上存在漏洞而未中标。针对以上问题，我们通过对这些年课题评审情况进行深入研究，结合这几年对申请书进行修改的经验，组织在国家自然科学基金委员会工作多年的资深科研管理人员和参加评审的专家教授组成了咨询中心，对您的申请书提出详细、全面的修改意见（主要是与生命科学有关的课题）。咨询内容：1、简表填写是否规范，包括申请金额是否合理、投送学科是否恰当、参加人员技术力量的配备是否合适，等等；2、选题方向是否科学、有创新、有科学意义，立项依据是否充分、清楚而没有漏洞，国内外的参考文献是否全面、准确；3、目标、内容和关键问题的选择是否得当，叙述是否充分而有条理；4、技术路线的设计和实验方案的选择是否先进、科学、合理、可行，描述是否清晰、简练；5、工作基础中，是否将与课题的研究内容相关的研究工作，清楚、透彻、技巧地进行了阐述，使评审者对课题组的前期工作和科研条件有足够的了解和认识；6、经费预算是否合理地按有关规定进行计算；7、成员介绍是否紧扣课题的研究内容和技术路线，既注重梯队、比例、技术力量等科研综合实力的展示，又注意与本课题相关；8、标书是否思路清晰、表达清楚，圆满而无漏洞，尤其是创新性、可行性和工作基础三方面的表述是否层次分明而又紧密结合、前后呼应。
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如何撰写2015年国自然标书—记南医大科技处南张正东处长
一、准备阶段-阅读指南准备阶段-科研选题以科学问题为导向:1.实际工作2.学术争论3.项目指南4.课题延伸5.改变研究要素(被试因素-受试对象-效应指标三大要素)-可以作为一种捷径！6.学科交叉(发散性思维)-idea7.避免脱离自身学科、避免选题应用方向（要基础-应用基础）；选题基本原则1.创新性-全球范围是研究灵魂，求新、求真、独到的见解：研究价值-对科学的书籍贡献；2.科学性：现象科学存在-提出的问题符合逻辑；3.可行性：规定的时间-合理-可行（能获得预期结果）。申请者具备的能力（实验、组织、协调）。二、题目及摘要1.题目：要有新意、吸引人，既要突出主题-容易理解，又要有少量的新词或缩写，体现与时俱进或引起兴趣。2.摘要：2.1该领域的存在的问题或难点2.2近年来国内外研究进展及提示2.3科学假设或设想2.4本课题拟采取何技术或手段2.5科学意义和价值所在举例-椎板切除术后硬膜—长链非编码（incRNA）是长度超200个核苷酸的非编码功能性RNA，参与肿瘤发生发展。其自己的标书 立项依据重点说明为什么要做？字左右。避免空话大话，不得要领。避免写成综述。分层次展开：研究现状评述，引出当前研究热点。中庸-不偏激，言之有据。分析存在的问题，凝练出科学问题，病阐述其重要性及其意义。抓住关键问题，并结合自己的前期研究工作提出假说和研究设想。本项目的意义和创新之处参考文献：引用权威杂志如Cell、nature、science等最好，近3年。如有自引更好。格式规范-美观统一。立项依据与研究内容（）有粗体的-让评委只读加黑的就理解自己的意思-加黑的有连贯性。最后一段：研究的意义。该研究结果可为进一步……研究打下基础。4.2研究目标、内容、您解决的关键科学问题重点回答做什么？研究目标：取得主要成果，具体明确新颖。研究内容：为实现目标而作总体要求：范围合适-重点突出-小题大做深做。拟解决的关键科学问题：完成本研究在理论和技术上，尤其是突破理论上的瓶颈，什么对策？不宜过多：国自然2-3个，青年1-2个。有的一句话就行。研究内容4个每个6行，不要再重复。研究目标：2个拟解决的关键问题：3个研究方案重点回答如何做？是重要依据。是专家最容易挑毛病的地方。需要按重要节点或构成进行分解描述，但避免写成protocol。合理、可靠、环环相扣，尤其不能出现低级错误。采用的重要研究方法和技术体现先进可靠创新或独特。并在叙述时让评审者相信申请人确实掌握了该方法，不能有外行话。个人建议把独创内容加入到研究内容中。研究方法及关键技术（与研究内容有一点差异）具体示范：1.样本量计算2.研究对象3.流行学调查4.样本采集5.伦理学筛查6.最后统计学分析7.运用什么数据库？如epidata等，具体，体现自己精通统计学分析方法。8.技术路线-分三块9.流行病学—功能学研究-生物学研究方框—椭圆形-两种图形申请者自我表现；体现自己的能力和思想的地方。理论上可行&&&&&&& 技术上可行材料实验或协作条件可行知识技能可行。避免理论指导。前期研究或预研究情况分析除对本单位的研究实力进行恰当的分析外，可以寻找比自己单位强的合作伙伴。主张多中心合作。人无我有，人有我新。拔高一点。与国内外进行必要的对比分析，既要结合实际又要稍作拔高。展示自己的第二次机会。应对立项依据自己的先讲已有的研究报道停留在差异表达上，未进行按年度研究计划及进展第1年-准备及初步研究，最后数据分析，总结，成文等。研究目标的实现。具体研究除垢面上3-4条。要具体体现基础和应用价值。8.1取得成果：论文、专利等。SCi论文，不看重中文的。2-3篇。档次5分以上，最后10分以上。青年3分以上-2-3篇。切记过多、不切实际。8.2人才培养：团队。研究生。8.3学术交流：主办、参与国际国内学术会议。8.4预期研究成果：重点10篇，参加会议3-5次，培养博士5-8名，研究生10-20名等。结合自己实际情况稍变化。9.研究基础与工作条件有关的研究工作积累和已经取得的成绩：有关项目-论文-成果-专利及应用有关技术方法的经历，是展示自己实力的第三次机会。已经完成的预实验的数据和图表：正式-美观-大方-参照发表格制作。太多-会引起疑问！！！已经具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径。项目成员介绍经费预算10.总结：好标书的特征脸面-印象好-给人清晰、深刻的第一印象。正文如躯体-曲线分明，回答三个问题立项依据-研究目标内容-方案-要完成回答为什么要做？做什么？如何做？三个问题。研究基础和工作条件：双下肢字词句运用的正确性和生动性，表述的逻辑性。层次感和完整性及图表和排版等的美观性等内涵的体现，能够体现严谨性、科学性和责任感。
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精神科好评科室
精神科分类问答瘤细胞转移的新的分子机制。
（三）拟采取的研究方案及可行性分析。
１.研究方法
GST-pull down，荧光共定位，内源、外源免疫共沉淀，蔗糖密度梯度超速离心，磷酸化实验，定点突变，稳定表达细胞株的筛选，RNAi抑制Pyk2表达，细胞迁移、侵袭实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验，免疫组化，定量PCR，Western检测等。
２.关键技术说明：
1）磷酸化实验
首先应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为阳性参照，以纯化的GST-E-cadherin蛋白为底物，以GST蛋白作为阴性对照，观察Pyk2 是否可以磷酸化E-cadherin。如果能磷酸化E-cadherin则应用生物信息分析，定点突变，寻找磷酸化位点；如果不能磷酸化E-cadherin，则以通用底物E4Y1作为底物，加入不同量的E-cadherin观察是否可以影响Pyk2的激酶活性。
2）细胞迁移实验
首先分别用空载体PCDNA3.1， PCDNA3.1-Pyk2-Myc，PCDNA3.1-PRNK-Myc转染肝癌细胞株（PRNK为Pyk2的C段，为Pyk2的失活突变体），用G418筛选出稳定表达细胞株。并检测稳定表达细胞株Pyk2蛋白表达量的不同。
然后应用稳定表达细胞株做Transwell细胞迁移和侵袭实验，比较细胞迁移率的变化；检测细胞迁移率的变化与Pyk2蛋白表达量的关系。同时取相应细胞做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平、蛋白水平、磷酸化水平的变化以及这些变化与肿瘤迁移的关系，与Pyk2蛋白表达量的关系。
3）裸鼠成瘤肿瘤转移实验
取上述三组稳定表达细胞株分别接种裸鼠，待肿瘤直径约1-1.5cm时取出肿瘤重新接种于另外一批裸鼠的肝左叶。接种5星期左右处死裸鼠，收集肝脏和肺脏，观察肝内转移情况和肺转移情况。检测三组肿瘤Pyk2蛋白表达量的不同以及与肿瘤转移的关系。同时取相应肿瘤做定量PCR，Western蛋白定量，磷酸化抗体检测磷酸化状态来比较E-cadherin在转录水平、蛋白水平、磷酸化水平的变化，确定这些变化与肿瘤转移的关系，与Pyk2蛋白表达量的关系。
4）蔗糖密度梯度超速离心定位和内源免疫共沉淀
取肝癌肿瘤的癌旁组织，裂解离心，取裂解液上清，蔗糖密度梯度超速离心。取离心后的不同组分样品做Western，分别用E-cadherin抗体和Pyk2抗体作为一抗检测。如果二者表达最多的峰值是在同一个组分中，则提示我们二者在细胞内是共定位的。
取上述二者的表达较多的组分，用Pyk2单抗免疫沉淀Pyk2（免疫球蛋白作对照），
然后用E-cadherin单抗杂交检测E-cadherin是否能与Pyk2共沉淀下来。相反方向则是：用E-cadherin单抗免疫沉淀E-cadherin（免疫球蛋白作对照），然后用Pyk2单抗杂交检测Pyk2是否能与E-cadherin共沉淀下来。
３.技术路线（见下图）
1. 左侧部分：取E-cadherin与Pyk2不同结构域和不同突变体，应用酵母双杂交、
GST-Pull Down以及免疫共沉淀的方法确定二者相互作用的结构域，以及作用位点。荧光共定位，免疫组化，蔗糖密度梯度超速离心等方法验证二者在细胞以及肿瘤组织中共定位；磷酸化实验确定E-cadherin是Pyk2的磷酸化底物，以及磷酸化位点。这部分内容从生化的角度确定Pyk2磷酸化E-cadherin的分子机制。
2. 中间部分：通过细胞迁移实验、裸鼠成瘤转移实验从细胞水平、动物模型确定：Pyk2
通过磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移的机制。
3. 右侧部分：收集肝癌病人标本和临床资料，通过免疫组化、Western等方法检测
E-cadherin /Pyk2蛋白水平、磷酸化状态，分析二者表达量的相关性，以及与肝癌转移的相关性。
4. 最下面部分为汇总数据，总结分析。
4.可行性分析
1） 前期实验已经从酵母双杂交、GST-Pull Down、免疫共沉淀等证实了
E-cadherin与Pyk2相互作用(见研究基础部分)，而且二者功能上密切相关。E-cadherin作为一种细胞黏附分子在细胞黏附、细胞迁移和接触抑制方面具有作用。而Pyk2能通过各种信号途径参与调节细胞黏附、扩散和迁移等过程。因此，二者在功能上是有互相作用基础的。
考虑到Pyk2是一个激酶蛋白，且前期实验结果提示Pyk2激酶区域结合E-cadherin，因此有两种可能，一种是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一种是E-cadherin抑制Pyk2激酶活性。我们认为第一种可能性较大。根据文献报道，Pyk2能磷酸化E-cadherin的同源蛋白VE-cadherin并且抑制其与Catenin、P120等形成复合体，从而影响细胞迁移。
E-cadherin与VE-cadherin同源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin应该就有可能磷酸化E-cadherin。因此我们有理由推测，由于肿瘤始动因素的作用，Pyk2表达增多，活性增强，从而磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin降解，最终使细胞迁移性增强。我们上述实验设计基本基于这个逻辑。磷酸化实验证实Pyk2磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin蛋白减少。细胞迁移实验和动物实验设计逻辑是通过Pyk2过表达，检测E-cadherin磷酸化增强，蛋白量减少，导致细胞迁移增强或者肿瘤转移增加；RNAi抑制Pyk2的表达，则出现相反的结果，E-cadherin磷酸化减弱，蛋白量增加，导致细胞侵袭性减弱和肿瘤肺转移减少。事实是否如此，需要实验来证明。
申请人以前的工作曾发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员γ- Protocadherins能够抑制Pyk2的活性，因此从逻辑上讲也不能完全排除第二种可能性，即E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。如果是这样的话，则可能的假设是：在正常细胞中，E-cadherin抑制Pyk2的活性，在肿瘤条件下，由于其他原因E-cadherin减少或消失，而不能抑制Pyk2活性，导致Pyk2活性增强，因而肿瘤细胞迁移性增强。如果基于这个逻辑的话，实验设计就要改变为：磷酸化实验时应用酪氨酸激酶的通用底物E4Y1作为底物，观察E-cadherin对Pyk2激酶活性是否有抑制作用。然后筛选E-cadherin过表达、功能失活突变体和空载体的稳定表达肝癌细胞株，然后行细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验，观察E-cadherin蛋白过表达或功能失活突变后与细胞迁移或者肿瘤转移的关系，同时检测其与Pyk2蛋白表达量及磷酸化水平相关性。但是申请人在完成γ- Protocadherins抑制Pyk2的活性的工作中曾取E-cadherin做对比参照，结果发现E-cadherin抑制Pyk2激酶活性不是很明显，因此这种可能性不大。
从上面的分析来看，本课题在理论和逻辑上是可行的。
2）本课题是本人前期工作的延续，本人对E-cadherin/Pyk2的研究非常熟悉，前期工作构建的质粒表达载体等为本课题的下一步研究提供了很多有利的条件。本课题组的成员对所需要的技术方法都很熟练，且都有相应的工作基础，可以在各个方面进行协作。
3）本课题所涉及的技术均为较成熟的技术，所需的设备和条件本校都具备。
（四）本课题的特色与创新之处
1.本课题通过酵母双杂交新发现一个与E-cadherin相互作用的蛋白--非受体型酪氨酸激酶Pyk2，并证明两者的相互作用可靠，国内外研究至今未曾见过报道，具有国际先进性和独创性。（有报道二者的表达量与肿瘤转移的关系，但是二者直接相互作用未见报道。）
2. 本课题新发现Pyk2磷酸化E-cadherin影响肝癌细胞转移的机制，对于
E-cadherin在肝癌转移过程中的分子机制有新的理解，因此具有独创性和先进性。
（五）年度研究计划及预期研究结果
1.年度研究计划
1.12 磷酸化实验确定二者的调节关系，肝癌组织内源免疫共沉淀确定相互
作用可靠，同时确定二者结合的结构域，磷酸化位点。蔗糖密度梯度
超速离心，荧光共定位等相关的实验进一步确证二者共定位。同时收
集病例标本，收集临床资料。纯化蛋白制备抗体。
细胞迁移实验，裸鼠成瘤肿瘤转移实验检测Pyk2的表达与
E-cadherin的磷酸化状态，以及细胞迁移的关系，确定其调节机制。
同时完成E-cadherin/Pyk2的表达以及磷酸化状态与肝癌的分期、转
移、预后、复发等临床指标的相关性分析。
3.12 补充实验遗漏，整理实验资料，统计处理实验数据，撰写论文。
2.预期研究结果
1)确定Pyk2能够磷酸化E-cadherin，以及二者相互作用的结构域以及磷酸化位点。
2)确定Pyk2通过磷酸化E-cadherin，从而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移。
3)确定在肝癌组织中E-cadherin蛋白水平、磷酸化状态和Pyk2表达量的相关性，以及二者的表达与肝癌转移的相关性。
4)在国外学术期刊上发表SCI论文2-4篇，其中影响因子大于5的有一篇以上。在国内核心期刊发表论文2-4篇，并在国内外学术会议交流。
5)培养研究生2-3名。
二、研究基础与工作条件
（一） 研究基础
第一步：为了研究肝癌转移的机制，首先选取E-cadherin（胞内段，以下实验同）为诱饵在肝脏的cDNA文库中做酵母双杂交，寻找与E-cadherin相互作用的蛋白。我们先选取的是LACZ系统蓝白斑筛选，但是因为背景高而放弃。后来选取CytoTRAP系统，背景明显减低，测序后有意义的基因有31个。其中有4个为Pyk2片段。通过克隆Pyk2基因全 长验证，确定二者在酵母中的相互作用是强阳性的（图1）。（同时验证Pyk2的同源蛋白
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