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毕业于医学院校，在医院工作，有相对丰富的护理经验
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PCR实验常见失败原因对策分析及体系优化
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pcr实验室污染与对策
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pcr实验室污染与对策
官方公共微信实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（qPCR）：其原理及操作步骤与普通PCR是一样的，只在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。先介绍下PCR原理。PCR的工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片断和与其两侧互补的寡核苷酸链引物经变性、退火及延伸三步反应的多次循环，使特定的DNA片断在数量上呈指数增加。PCR扩增首先需要一对引物，根据待扩增区域两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增片段的特异性和片段长度。反应体系由模板DNA、一对引物、dNTP、耐高温的DNA聚合酶、酶反应缓冲体系及必须的离子等所组成。PCR反应循环的第一步为加热变性，使双链模板DNA变性为单链；第二步为复性，每个引物将与互补的DNA序列杂交；第三步为延伸，在耐高温的DNA聚合酶作用下，以变性的单链DNA为模板，从引物3ˊ端开始按5ˊ→3ˊ方向合成DNA链。这样经过一个周期的变性——复性——延伸等三步反应就可以产生倍增的DNA，假设PCR的效率为100%,反复n周期后，理论上就能扩增2n倍。PCR反应一般30-40次循环，DNA片段可放大数百万倍。PCR原理简图实时荧光定量PCR采用专用PCR仪，能够自动在每个循环的特定阶段对反应体系的荧光强度进行检测，可以做到PCR每循环一次就收集一个数据建立实时扩增曲线，准确的确定起始DNA拷贝数，从而对样品的浓度进行准确的定量。目前有荧光染料和荧光探针两种方式荧光染料（SYBR Green I）SYBR GreenI 是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其扩增产物的检测非常理想。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green I荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBRGreen I 工作原理TaqMan 探针TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5，末端，而淬灭基团在3，末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光与3，端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5，外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断增加。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。TaqMan 探针工作原理荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念—— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越少。然后利用Ct值通过复杂的计算可以得出初始的cDNA模板量。（计算过程较复杂难懂，这里就不折磨大家了）本实验室所用试剂中含荧光染料SYBR Green I 实时荧光定量 PCR体系：Mix：10ulPrimer：1ulH2O：7ulcDNA：2ulMix中含有dNTP、DNA聚合酶、缓冲液等，primer 浓度为5uM （引物浓度不宜过大，容易出现引物二聚体）。过程：变性、退火、延伸三个过程时间、温度和循环数都根据说明书适度调整。
为减少误差，可以Mix、Primer各乘以样本量配混合物，每个孔加11ul。水以相应比例加入cDNA中，每个孔加9ul （水和cDNA总体积为9ul，cDNA体积可以适度微调）。加样过程中冰上操作，PCR前离心使溶液在孔底部混合均匀。（关于RNA系列我们就先到这里结束了，热烈欢迎同学们就自己熟悉的实验方法来投稿，分享你的成就！）科研有范(keyanyoufan)
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keyanyoufan为实验初学者提供详细的实验方法、原理及提醒实验过程中易犯错处。帮助科研人员更快进入实验状态，实验更有范儿。热门文章最新文章keyanyoufan为实验初学者提供详细的实验方法、原理及提醒实验过程中易犯错处。帮助科研人员更快进入实验状态，实验更有范儿。&&&&违法和不良信息举报电话：183-
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