编者按：光遗传学方法有望通过利用光以毫秒的精度操纵基因或功能定义的神经元的神经活动，彻底改变神经科学。然而，充分利用光遗传学工具的潜力需要光在正确的时间靶向正确的神经元。小编在这里给大家推荐Packer AM等发表在《Nature neuroscience》题为“Targeting neurons and photons for optogenetics”的综述文章，本综述中，作者讨论了解决这个问题的一些阻力和潜在的解决方案。研究人员回顾了在基因、病毒或活性依赖控制下，将光激活分子的表达靶向于特定细胞类型的方法。探索新的方法，将光照射到单个神经元，使其能够精确激活和失活。这些技术在神经元的时间和空间激活方面提供了以前实验无法实现的精度。结合同步记录和成像技术，这些策略将使我们能够模拟体内神经元的自然活动模式，从而实现以前不可能的“梦实验”。图1. 光遗传学的操纵策略一、将光遗传学探针表达在特定类型的神经元大脑由不同形态和功能的神经元组成，这些神经元分布于不同的环路行使不同的功能。在哺乳动物视网膜中，具有相同形态和功能的神经元被视为一个基本的神经网络单元，称为细胞类型。与电刺激手段相比，光遗传学的一个关键优势在于，可以随机操纵一类神经元或者特定类型的神经元。特定类型的神经元可以是形态相似的神经元，例如单个视网膜神经节细胞；也可以是一类细胞亚型，例如大脑区域中表达小清蛋白的神经元；还可以是代表特定功能的细胞类型，例如视觉皮层中响应特定刺激的神经元。在非人灵长类动物中，通过遗传学手段对特定类型神经元进行操作基本不可行，如何在特定类型神经元表达光遗传学探针仍是一个需要解决的问题。1.将病毒作为光遗传学探针靶向的传递工具病毒工具是光遗传学探针靶向神经元最有效的工具，因为病毒相比于神经元小很多，可以随时注射到大脑任何区域，还可以搭载光遗传学探针并进行高表达。病毒被认为是包含可修改的特定功能模块的小型工具。在多种病毒工具中，最常用于靶向神经元的是腺相关病毒（AAV），其存在于自然界中的100种不同变体中，并且可以通过人工修饰产生数百万种变体。通过突变病毒的衣壳蛋白，可以修饰病毒特性，例如，将进入位点从轴突改变为体细胞或树突。此外，可以使用不同病毒的组合进行研究，例如，伪狂犬病毒与工程化的AAV组合进行跨一级突触的研究。在光遗传学的研究过程中，病毒的滴度是一个经常被忽视的变化因素，通常病毒滴度的对数单位一般在106-1013范围内变化，如果病毒滴度范围不对，光遗传学探针的表达能力将大大降低。脂质包被的病毒（例如狂犬病毒）不能很好地渗透到脑组织中；而使用小型非脂质包被的病毒（例如AAV）则可实现最佳渗透。此外病毒的注射体积，注射速度，停针的时间和病毒对相邻细胞表面的亲和力均可以影响注射部位的细胞被病毒感染的水平。2.根据神经元的基因特性进行特异性表达不同神经元形态和功能的差异很大程度上由它们表达的基因模式所决定，因此可以利用神经元的基因特性，结合位点特异性的重组酶（Cre或Flp），将光遗传学探针表达在特定的神经元类型上。该方案主要缺点是病毒难以做到在特定细胞类型表达重组酶，因此替代方案为使用转基因动物。此外，通过启动子元件，将病毒直接靶向需要研究的特定类型的细胞亚群是一种有效的病毒策略。3.根据环路的连接性进行特异性表达一些细胞类型具有特定的连接模式，例如特定的远距离轴突投射，或与其他神经元形成局部环路连接。根据神经元的连接特征，与跨突触感染病毒相结合，可以将光遗传学探针表达在特异性环路连接的神经元上。例如通过注射能够感染神经元轴突末端的病毒（疱疹病毒、狂犬病毒），从而逆轴浆运输将光遗传学探针表达在特定脑区的神经元胞体上，进而能确定光激活的特定类型投射神经元。使用跨单突触逆行病毒表达的光遗传探针可以用来证明突触后与突触前神经元之间的连接性。而使用跨单突触顺行病毒，可顺着轴突投射的方向，标记下游的投射神经元，因此该方案是研究跨两级突触的神经环路的有效手段。图2. 根据环路的连接性特异性表达光遗传学探针4.光遗传学探针的长期表达神经科学中主要的研究方向是关注突触连接的形成，维持和消除的长期变化，因此使用光遗传学方案研究该问题，要保持光遗传学探针的低毒性和长期稳定性。使用转基因小鼠，AAV病毒，或者电穿孔可以实现低毒性的表达。但是，实现长期稳定性的表达目前仍有待提升，长期表达最稳定的方法是使用转基因动物，因为对相同的神经元具有类似的遗传学背景。5.光遗传学探针的单细胞特异性表达通过单细胞电穿孔技术可以精确地将光遗传探针表达于单个神经元，该方案包括使用双光子显微镜将带有光遗传学探针的质粒定向贴附到单个神经元，然后通过电穿孔将质粒递送到细胞内。这种方式可以根据神经元的树突形态、遗传特性或功能特性来进行后续的光遗传激活。图3. 单细胞电穿孔技术表达光遗传学探针二、有效的光递送方式解决了将光遗传学探针靶向特定类型神经元的问题，下一个就是如何有效的将光递送到特定类型的神经元，以达到精确和快速地对单个神经元进行有效的激活。1.动物模型的选择光遗传学方法已经被应用到线虫、斑马鱼、啮齿动物和非人灵长类动物等动物模型。透明的动物有利于光遗传学的光递送，但哺乳动物的神经系统进行有效的光递送仍需要进行进一步优化。2.视蛋白的选择确定动物模型之后，下一步是考虑使用哪种光遗传学视蛋白。这需要考虑到操纵的方向(刺激、抑制或双向操纵)、操纵的时间(毫秒级的尖峰控制，或者更长时间)以及所选择的光的波长。此外视蛋白的表达水平也是需要考虑的关键问题，病毒通常能引起视蛋白的高水平表达，但是高表达的视蛋白也许会具有长期毒性。3.激发光光源的选择激发光的光源可以是氙气灯泡、发光二极管(LED)、连续波激光器或超快脉冲激光器。氙气灯泡产生的光谱很广，随后进行滤波以获得所需的波长。灯泡在整个频谱中产生的功率最高，因此需要经常更换(200-2000小时)。LED寿命更长(10000-100000小时)，并可以产生特定波长的光。4.光源递送方式光源递送方式需要考虑实验是在体外还是体内进行。体外实验通常使用可以耦合光源的显微镜进行光递送，或者在显微镜的荧光激发端口上安装LED或激光光源。如果固定动物的头部，则可以用生物显微镜进行体内实验。而在自由移动的动物模型中，则通常使用光纤进行光递送。5.光散射的影响当在生物组织中进行光递送时，必须考虑光散射的影响。散射是光子偏离其原来的传播路径，而在生物组织中光源通常以各向异性的方式高度散射，这意味着样品内部的光分布与观察样品外光源是不匹配。实验中可以通过蒙特卡罗模拟进行校准。6.读取神经元的活动读取神经元的活动最好方法是将光遗传操作与电生理记录相结合，通过电生理记录提供对神经元活动的实时监测。目前有一系列的组合可以运用，例如将电极四极管与光纤一起植入、光遗传学与膜片钳记录结合等。此外采用钙成像结合光遗传学也可以对神经元的活动方式进行监测。7.结果可视化结果可视化的最简单形式是通过移动样品来引导光束，将衍射的光点限制在感兴趣的区域，并通过空间光调制器（SLM）定向将多个光束产生空间图形。这种光学成像方式比较简单，但成像的效率较低。通过全息投影在显微镜观察视野中创建全息投影图案则是更好的可视化方案。 图4. 光遗传学结果可视化的方案8.双光子激发策略上面讨论的图形可视化方案依赖于单光子激发，而双光子激发可以在轴向和横向两个维度都提供高空间分辨率，具有单光子无法比拟的成像效果。例如双光子激发视紫红质蛋白过程中，以螺旋模式扫描高表达视蛋白的神经元可以形成光刺激电流的有效时空整合，从而产生相应的电流活动，进而产生特定的可视化图形。双光子显微镜的超高空间分辨率可以在亚细胞水平上更精细地观察神经元功能，例如光特异性的激活树突部位的视蛋白产生电活动，结合电生理记录可以很好地研究神经元的单突触连接的模式。 图5. 双光子激发策略 1P：单光子；2P：双光子表1. 光靶向策略的比较三、靶向光遗传学策略的应用场景目前光遗传学策略在全球范围内正得到积极的推广，此外，各种策略与光遗传学的组合极大地拓展了光遗传学的运用范围，靶向光遗传学策略就是运用比较广泛的组合策略，可以解决许多神经科学的难题。1.定义神经元类型如何定义神经元类型仍是神经科学中一个有争议的问题，无论是基于形态学特征的传统定义方式，或者是电生理学和遗传学的补充方案，均不能严格区分出不同类型的神经元。将光遗传学探针靶向特定的神经元类型，结合遗传学、生理学和功能学，将重塑神经元的解剖学分类。该方案可以通过激活或失活特定的细胞类型，对介导行为过程的特定细胞类型进行精确的划分。2.解析驱动行为效应的最小神经单元活性神经元的数量和行为效应之间的驱动关系目前尚不清楚。而光遗传学通过将光遗传探针定向表达到特定数量的神经元，通过激活(或失活)特定数目的神经元，可以回答需要多少活性神经元才能驱动行为学效应这一根本问题，进而解析出驱动行为学效应的最小神经单元。3.破解驱动行为学效应的时空神经代码破解驱动行为的神经代码长期以来一直是神经科学的底层问题，因为行为效应的驱动在毫秒时间尺度上会有数以千计的神经元参与。要破解神经代码，就需要确定驱动行为学效应神经元的时空活动模式，光遗传学需要将特定类型的神经元亚群，以生理模式相同的时间和空间精度，将神经元的此类时空活动重现在特定的时空环路中。该方案需要结合使用神经元活动指示器（电生理或钙成像）对神经元活动进行空间读取，然后以高时空分辨率对相同神经元进行光遗传学操作，进而重塑环路的时空活动，解析驱动行为学效应的神经代码。 图6. 靶向光遗传学破解驱动行为的神经代码}