1.掌握电泳分离蛋白质的基本原理。

2.掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质技术。

1.电泳使带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动；颗粒体积越小、表面越光滑、所带电荷越多，泳动越快；凭借在电场中的移速的差异，不同的颗粒自然分离成数条区带。

2.血清蛋白可细分为五种蛋白，各自具有不同的体积大小、形状和等电点；因此，通过电泳以及染色后，即可观察到清晰的色带。

1.泡膜，将薄膜浸泡在缓冲液[1]中。

2.上样，上样前，用滤纸吸干[2]薄膜[3]上多余的缓冲液； 后用塑料片垂直蘸取血清，在毛面上距离薄膜一端约2cm处上样一次即可，盖完后能观察到一个浅浅的样品条；上样后，样品会被薄膜吸收。[3]

3.放样，用两个镊子分别夹住薄膜两端，把膜放到滤纸桥上，并确保样品端位于负极端[4]，同时保持血清样品位于滤纸桥内侧[5]；毛面朝下放置[6]，并用镊子在两端拉紧薄膜[7]。

4.电泳，在恒压电源下经过一个小时左右后，取下薄膜。

5.染色，将薄膜完全浸入到氨基黑染色剂中，染成深蓝色，染色时间至少五分钟（多个薄膜同时染色时要防止黏连，待前一条完全浸没时，才能放入下一条）。

6.漂洗[8]，用三份漂洗液依次进行漂洗，各漂洗三分钟，漂洗好后的深蓝色条带即为蛋白质条带，可观察到蛋白质分离的结果。

7.观察分析所得的蛋白质条带。

1.用镊子戳条带中部的样品区，可能会刮落蛋白，出现斑驳，最好通过两端持拿。

2.染料挥发后条带颜色会变淡，用胶带纸封住会保持较好。

3.多个薄膜同时进行实验时，最好做有标记。

4.吸干薄膜上多余的缓冲液后及时点样，防止薄膜完全干燥。

1.蛋白质条带的深浅和粗细对比显示着含量比。

2.蛋白质电泳需要介质，介质提供了一个不仅可以使蛋白质泳动而且可使蛋白质具有不同泳动速率的环境。

3.蛋白质颗粒在电场中移动速率与颗粒的体积大小（越是小又轻越快）、形状（越是光滑越快）、表面电荷多少（越多越快）有关。

[1]缓冲液浸湿薄膜，提供了PH8.6（PH>PI）的缓冲环境，使蛋白质带上电荷。

[2]防止血清样本流动

[3]薄膜的一面较光滑，铺有防水膜（防止样品泄漏），只有摩擦面又称毛面才可以上样。可在灯光下判断，光泽较暗的一面是毛面，即上样面。

[4]滤纸桥有正负极，因PH>PI，蛋白质颗粒带负电

[5]血清若与滤纸桥接触，则会被吸收；若位于外侧，则无法成功进行电泳

[6]防止薄膜上的缓冲液干掉，失去缓冲液，蛋白质就会失去电荷，无法泳动

[7]防止下塌，因蛋白质是水平逃脱

[8]染色后，整个薄膜都是深蓝色，仍无法观察到蛋白质条带情况，因此需通过漂洗洗去背景色。

姓 名： 学 号: 专业年级: 组 别:

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称 实验日期 合作者 评分

血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及其定量

1、１、学习醋酸纤维薄膜电泳得基本原理与操作方法； 1、2、了解电泳技术得一般原理；

１、3、掌握电泳分离血清蛋白质及其定性定量得方法。

2、1、血清中各种蛋白质得等电点不同，一般都低于pＨ７、4。它们在pH8、6得缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动.由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带得电荷量不同，在醋酸纤维素薄膜上电泳得速度也不同。因此可以将它们分离

为清蛋白(Ａlbumin）、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β－球蛋白、γ-球蛋白5条区带.

2、2、血清中不同蛋白质得等电点、分子量及含量

血清蛋白质 等电点 分子量 占总蛋白得%

α1－球蛋白 5、０6 2００，0０0 2～５

血清蛋白带负电荷,在电场中向正极移动。 预测血清蛋白电泳区带图

血清蛋白依次分为清蛋白，球蛋白得α１、α2、β、γ五个区带

2、3、①膜条经过氨基黑1０B染色后显出清晰色带;②各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比；③可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中；④用分光光度法计算各种蛋白质得百分数。

3、1、1、实验试剂：①样品:健康人血清（新鲜、无溶血);②巴比妥―巴比妥钠缓冲液（pH8、６,离子强度０、０6mol/L）;③氨基黑１0Ｂ染色液;④漂洗液;⑤洗脱液：0、4mol/NaOH溶液。

３、１、2、实验器材：①Ｖ－１100分光光度计(×1）；②恒温水浴箱(×１）;③试管(×6)、试管架(×1）；④1000μL加样枪(×1)、加样枪架(×1);⑤醋酸纤维薄膜（2cm*8ｃm,厚度１20μm）；⑥培养皿(×5)；⑦点样器或载玻片(×１）；⑧平头镊子(×2）;⑨剪刀（×1）;⑩电泳槽（×１)；?直流稳压电泳仪（×１) 3、2、实验步骤

1．准备与点样:①取２×8cｍ得膜条；②亚光面距一端１、5ｃm处取一点样线；③充分浸透在巴比妥缓冲液中；④取出膜条，用滤纸吸去多余得缓冲液；⑤点样器下端粘上薄层血清;⑥垂直点样。 点样示意图： 注意:点样线尽量点得细窄而均匀. ― 小组标记 样品标记 8cmm点样线 点样区 (粗面) + 2cm 2.电泳:①放置膜条（点样面向下，点样端置于阴极）;②膜条贴紧滤纸，拉直膜条;③平衡五分钟；④通电（调节电压12０ｖ/电流，时间:４5~60 mｉｎ）；③关闭电源. 1、电泳槽解剖图: 5cm

３、染色、漂洗：①通电完毕；②取出膜条；③浸于染色液(氨基黑10Ｂ）中，5ｍiｎ;④取出膜条，浸于漂洗液；⑤反复漂洗2次,直至漂净；⑥滤纸吸干薄膜。 4、定量(洗脱比色法）(因实验室等原因，未做) 四、结果与讨论：

本次实验得到得图谱只能够清晰得瞧出清蛋白与γ―球蛋白得区带,其余无法区别。原因可能如下:

①醋酸纤维薄膜质量不足

②薄膜过湿，样品扩散迅速,导致样品分离不成区带. ③点样太少,区带显色不明显. ④电泳时间不足.

⑤薄膜在缓冲液中浸泡得时间不足。

⑤取出电泳后得薄膜过程中曾不慎将薄膜掉到地上。

⑥染色时，因为现场混乱，可能导致醋酸纤维薄膜不就是一张一张放入染色液得，在染色固定前,薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定得血清蛋白彼此粘连.

1.电泳时,点样端置于电场得正极还就是负极？为什么？

答：点样端置于电场得负极。因为人体血清得蛋白质会因电槽中溶质呈碱性而带负电，要成功分离出各类各类蛋白质,理应将点样端置于电场得负极.

2.电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在得原因. 答:①醋酸纤维薄膜质量不足;②薄膜过湿，样品扩散迅速，导致样品分离不成区带;③点样太少,区带显色不明显；④染色时，醋酸纤维薄膜不就是一张一张放入染色液得,在染色固定前，薄膜与薄膜之间重叠,造成薄膜上还未固定得血清蛋白彼此粘连。⑤电泳时电压,电流或电泳过小或时间不够,造成区带未分离。