(1) 试剂 所需2.5%戊二醛、0.1M PH7.35 的磷酸盐缓冲液，注明配制日期及启用日期，置于 4 摄氏度冰箱预冷（2.5%戊二醛预冷至少 1 小时以上；磷酸盐缓冲液不宜长时间预冷，容易结晶）。

(2) 仪器与器材 锋利刀片（手术刀片或飞鹰双面刀片）、镊子、低温操作台、1.5mlEP 管、培养皿（或者硬纸卡，盛戊二醛用）、注射器（植物组织用）、冷冻离心机（细菌、细胞、藻类等需要离心的样品使用）

取材动作要迅速，材料离体后 1min 钟内必须进入戊二醛固定液，使组织、细胞尽可能保持原来生活状态，解剖器械要用锋利的刀片（新的手术刀片或飞鹰双面刀片）划切，避免牵拉或挤压，尽量减少取材中的机械损伤。（动物处死后 5min 内完成此步骤，时间越短越好！）

②部位要准确：如观察肾脏肾小球或脑神经元需取皮质而不要取髓质，观察胰岛尽量取胰尾。

③胃肠道、皮肤、角膜、视网膜、耳蜗、骨骼肌等要注意方向性（横切或纵切），取材成条状（0.5mm×1mm×3mm），确保要观察的部位在较长的切面上。

取材过程应在 0~4 摄氏度的操作台上操作（或者是冰上操作，但要注意切勿使组织直接接触或贴近冰面，需要以操作面板隔离，以免操作时间过长而造成组织结冰出现冰晶损伤），所有器械、容器、2.5%戊二醛、PBS 需 4℃预冷足够长的时间。

不定位组织大小为 1mm×1mm×1mm（尽可能小，可以更小为 0.5mm×0.5mm×1mm，越薄越好），如肝、肺、脾等不需要看特定结构的非定位器官组织；定位组织如神经、骨骼肌、肾、脑、肠、血管、胰岛等组织取材大小为 0.5mm×1mm×3mm 的长条状（越薄越好）。

(1) 浸入固定 麻醉（1%戊巴比妥钠铵 5ml/kg 体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖刀（锋利刀片）取一小块组织，立即（越快越好，1~3min 完成此操作）放入盛有预冷 2.5%戊二醛的培养皿（或硬纸片上）中，随后立即沿小块组织边缘（已经被固定）用锋利刀片取 1mm×1mm×1mm 或 0.5mm×1mm×3mm 大小组织置于盛有预冷 2.5%戊二醛 1.5mlEP 管中继续固定，4℃保存（请勿靠近冰箱边上造成标本冷冻结冰！！！）。

(2) 灌注固定 脑组织等（初次取材者或未常规做灌注固定者此方法慎用，因在 TEM 结果出来前无法评价其固定是否成功）。

(1) 贴壁细胞 培养好的细胞不经漂洗直接倒出培养液后迅速加足量预冷 2.5%戊二醛固定1h(戊二醛完全浸没细胞)，随后用细胞铲或细胞刮成 45°倾角快速铲下细胞（勿用胰蛋白酶消化）后全部转移到 15~50ml 离心管内，转速 500~800rpm 离心 5min 成团（细胞团大小约半个至一个绿豆大小为宜），随后去除大部分上清液（留 1ml 左右，切勿丢失细胞），将离心管里的细胞轻轻吹散后转移到 1.5ml 的 EP 管内，垂直静置自然沉降 1h 后轻轻吸去上清液（切勿丢失细胞），再沿管壁缓缓加入 1ml 新预冷 2.5%戊二醛，随后置于 4℃冰箱固定保存。（此过程操作轻柔，切勿损伤细胞！）

(2) 悬浮细胞 直接将细胞培养液全部转移到 15~50ml 离心管内，转速 500~800rpm 离心5min 成团（细胞团大小约半个至一个绿豆大小为宜），随后去除大部分上清液（留 1ml 左右，切勿丢失细胞），将离心管里的细胞轻轻吹散后转移到 1.5ml 的 EP 管内，垂直静置自然沉降 1h 后轻轻吸去上清液（切勿丢失细胞），再沿管壁缓缓加入 1ml 新预冷 2.5%戊二醛，随后置于 4℃冰箱固定保存。（此过程操作轻柔，切勿损伤细胞！）

(3) 细菌悬液（固体培养基自行转移成悬浮液） 直接将细菌悬液全部转移到 15~50ml 离心管内，转800~1000rpm 离心 5min 成团（细胞团大小约半个至一个绿豆大小为宜），随后去除大部分上清液（留 1ml 左右，切勿丢失细菌），将离心管里的细菌轻轻吹散后转移到 1.5ml 的 EP 管内，垂直静置自然沉降 1h 后轻轻吸去上清液（切勿丢失细菌），再沿管壁缓缓加入 1ml 新预冷 2.5%戊二醛，随后置于 4℃冰箱固定保存。（此过程操作轻柔，切勿损伤细菌！）

(1) 植物取材较容易，取一小块植物组织浸入盛有预冷 2.5%戊二醛培养皿（或硬纸卡）上， 随后用锋利刀片切成 0.5mm×0.5mm×3mm 小长条薄片，随后抽取气体。

(2) 抽取气体 将植物组织同固定液一起倒入注射器，用乳胶手套食指堵住注射器出口，右手拉动针栓，将注射器口垂直向上，松开食指，右手轻推针栓使液面上的气泡从注射器口排出，反复多次，直至组织沉入固定液。

透射电镜生物样品运输基本要求

用封口膜将 1.5mlEP 管管盖再次封好，做好标记，填好送样申请单（必须填，随样品寄出纸质版申请单）。随后插在海绵板或可以减震的塑料上，用废旧报纸包裹，放入1-2个冰袋，样品尽可能远离冰袋固定放置，以防样品出现冰晶损伤，寄出。

电子显微镜科研服务项目

1、各种生物组织、细胞超微结构研究

2、各种病原微生物的超微结构研究（如病毒、支原体、细菌、真菌等）

3、各种原代培养的细胞类型鉴定

4、细胞表型转化的研究

5、细胞凋亡、自噬的形态学观察

6、各种疾病的超微病理变化研究

7、药物等各种实验因素对细胞超微结构影响的观察

8、细胞与细胞、细胞与其它物质相互作用

9、酶、抗原等的亚细胞结构定位（电镜细胞化学、免疫电镜）

10、各种细胞器的图像分析及三维重构

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超净工作台常规配置

七、培养基血清浓度问题。

问：在1640里加血清时加多了，90ml里加了20ml血清，约为18%，以前都是加10ml的，查了网上多建议用10%-15%，有关系吗？

答：我认为一般来说血清浓度的较大波动对细胞的状态影响较大，建议再加90ml1640调成10%。血清浓度大当然细胞状态感觉要好，但是高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱，影响后续实验的结果。10%的浓度培养鼻烟癌细胞很好。

八、心肌细胞原代培养时血清的使用问题。

1、问：在进行心肌细胞原代培养时，需要用含血清的培养基中止胰酶的消化作用，我现在使用的是含血清10%的培养液，但近日看北医一个细胞培养的课件发现，有用1%血清培养液进行中止消化的，想问一下，1%的是否可以，效果是否有保证？这样确实能节省不少血清的。答：关于心肌细胞元代培养的FBS问题：

(1)1%的血清完全培养基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌细胞元代培养就不行。10%的FBS完全培养基效果都不太好，开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS，20%左右，但这就有出现另一个问题，在FBS完全培养基中，成纤维细胞呈优势细胞，须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长，纯化心肌细胞。

(2)FBS的作用不仅仅是拿来中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用，有讲究：刚开始使用20%左右的高浓度的FBS，后逐渐递减为无血清的DMEM/F-12培养基培养。

2、问：我胰酶的用量是/content/sfs/brochures/B_08A00_0619_FBS_bro.pdf。第五页我做了个记号。直接点击链接就可以看到它的说明书页面。我想我们肯定要以公司的说明书为准。至于为什么检验科测起来有误差，我想可能是样本不一样，需要用标志品矫正有关。具体需要检验科的战友解释了。

十六、关于中和消化液需要的血清量。

问：用胰蛋白酶消化细胞后，需要用血清中和。具体这种中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之间的比例是多少？

答：做了很久的试验，真的没有想过胰酶和血清的对应关系。不过细想下来，这个应该也没有固定的比值。血清的品种都是不同的，成分必然有差异，如何能确定其与胰酶的比值关系？我们消化细胞的时候，如果是传代，细胞变形后，吸出胰酶直接加入适量的hanks液或者全培，这个量看自己的喜好和吹打细胞方便而定。一般都可以中止消化的。不会存在继续消化的事情。如果是从组织上消化细胞做原代培养，我一般都使用全培进行中止，而且加的很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例应该是足够的。当然全培是2，一般我养细胞的时候，会用国产的比较便宜的血清配制全培，专门用于中止消化，这样有几个好处：一是中止消化的效果应该好于hanks液吧，再是也有利于维持细胞活性。而且这部分液体会被离心去掉，血清便宜，离心掉了不会心疼。而养细胞的时候用好血清。个人观点，仅供参考。

十七、血清中的悬浮物问题。

1、问：发现培养的细胞瓶中背景有许多的小黑点，培养液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以为是胶原虫。本打算换液，换液前特意看了下前些天配的培养液，肉眼发现培养液中有悬浮的颗粒状物质(不多)，于是放在镜下观察，新鲜培养液中有一些悬浮的小颗粒，不多。(培养液是R1640+20%牛血清+1%双抗)于是又将分装在4℃保存的小牛血清拿出观察，肉眼可见5、6个白色小小球状的物质，在血清瓶稍靠下的部位悬浮。镜下观察，也有少量的不知什么物质的东西漂浮。小牛血清是Hyclone新西兰的，标签上写已经经过2μm滤膜过滤处理。根据上述培养液的情况，是否说明培养液已被污染？如果是正常的血清是不是在镜下不应该看到杂物，哪怕是极少量的？根据上述血清的描述，是不是说明血清也存在问题，还能用吗？补充：细胞培养以来生长状态就不好。买血清的时候厂家说明不用灭活，所以未灭活。

答：(1)血清应该-20℃保存，解冻血清时，请按照的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大实验显示非常容易产生沉淀物。(2)血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白在血清解冻后，也会存在于血清中，亦可造成沉淀物。(3)若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清，再放回冷冻，若存放于4℃时，请勿超过一个月，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

(4)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(5)排出了血清的原因，在考虑实验用品和无菌操作的问题。

(6)细菌病毒、衣原体、黑胶虫污染也很常见，如果细胞死的太多，影响较大建议更换培养液。

2、问：今天在配培养液时，发现血清里面有小碎片样的漂浮物，血清仍然清亮，不浑浊。不知道是什么，问了实验室的学长，说仍然可以用，但还是不放心，没有用血清。求助园子的各位达人，这可能是血清出了什么问题？我的血清用了一个月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培养液配置时Votex不够，当时是清亮的，但过一段时间会析出来；(2)真菌污染。

十八、污染和过滤的问题。

1、问：怀疑血清染菌，想用滤膜过滤一下，可否自己用0.22μm滤膜过滤？对血清性质有多大影响？有做过的么？

答：可以过滤的，血清当出厂时都是0.22μm或0.1μm过滤除菌。想证明有没有染菌不用过滤这么麻烦，只要放置于37℃过夜就可以了，如果有微生物污染会变浑浊的，如果还是澄清的就说明没有问题的。实验室中血清很难直接过滤，一般要加到培养基中再过滤。我们实验室制备培养基时，都使用滤膜过滤，一般而言如果制备1-2瓶培养基，一个滤膜及一支30ml注射器可以过滤50ml小牛血清。如果大量制备培养基也可以将血清加到培养基中，使用0.22微米的大滤膜一起过滤。

2、问：我怀疑我用的完全1640培养液被污染了，准备重新过滤消毒，过滤后是否需要补充胎牛血清？如需又如何补充？

答：完全1640培养液被污染了，如果是支原体的话，过滤没有作用，支原体可以通过滤膜。我们用1640液，都是配液后保留500ml，然后其他的分装100-200ml，现用现配因为血清比1640要贵，如果你想过滤的话，建议你加原比例血清，因为血清不会很容易通过滤膜。最主要的还是找到可能污染的原因。

3、问：加好了血清双抗的培养基由于污染了再过滤后还能用吗？ 答：建议不要用了。在加了双抗的情况下已经污染，那么细菌污染的可能性会较小了。一般的过滤除不能去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、问：我准备把使用的完全1640培养液重新过滤一遍，不知道培养液中的血清成分是否能通过滤膜，过滤后是否还需要补充胎牛血清？如需又如何补充？

答：可以透过，但是随着液体量的增多会很慢，如果不加压会比较麻烦，还有最好用低蛋白吸附的，不然损失是比较大的。

十九、更换无血清培养基后细胞大量死亡的问题。

问：我使用Lipofectamine2000转染成骨细胞，在转染前要换上无血清的培养基。本来条件模的好好的，转染效率也可以接受。但是寒假一回来就发生了怪事：细胞在有血清的培养基中长的好好的，一换无血清的培养基就死亡。大概4个小时就能看到较多的细胞飘起来。但是原来我换无血清培养基，就算放那里10个小时都是没问题的啊。已经换了不同批次的培养基，甚至吸管什么的都换过了，但是就是不行，是怎么回事？

答：(1)两周后的培养液应补加谷氨酰胺，或者重新配液，转染时应不含抗生素。

(2)确认操作方法和环境，建议检查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂质体的毒性很大，如果有质粒参与对细胞损伤更大，如果Lipofectamine2000在常温放置过，对细胞更大，假期冰箱是否断过电。

(4)培养箱的温度、c02浓度，湿度。

二十、完全培养液的相关定义。

问：“完全培养液一词”，是指加了血清的培养液吗？我在做含药血清的实验，涉及到血清添加量的问题。所以想弄明白文中所指的“完全培养液”是否是含药血清。

答：原液是指配置后过滤除菌。不完全培养液是指不含有血清的原液，其他成分已补充。完全培养液是指不完全培养液加入血清后称完全培养液。二

十一、血清相关知识总结。使用胎牛血清的注意事项：

血清是细胞培养中最重要的元素之一。下面是实验室里常会遇到的问题，仅供大家参考：

1、保存血清最好的方法： 建议血清应保存在-5℃ 至-2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

2、如何解冻血清才不会使产品质量受损：

建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理：

血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

一般是以 56℃，30 分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有 : 溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

5、关于胎牛血清的灭活： 有必要做热灭活吗？ 实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量！

6、血清相关知识： 如何避免沉淀物的产生？

我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作 :(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2O℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30 分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

细胞培养前需要准备的物品

提前开启37℃水浴锅和超净台的紫外灯；

灭菌吸头、1.5mL的离心管、空玻璃瓶；

无菌的10cm培养皿、16孔板、32孔板、96孔板、培养瓶等。

橡胶手套、普通移液器、电子移液器、装有99.9%-100%CO2钢瓶

1.取一瓶液体DMEM培养液（GIBCODMEM液体低糖培养基）、FBS血清、二抗，在放入超净台前用70%的酒精消毒；

2.向500mL的DMEM培养基中加入55mL的FBS血清，至终浓度为10%，再向其中加入双抗生素，一般保证抗生素的单位达到100Units（即500mL培养基中加入5mL 10,000单位的双抗生素，如果用于保藏的细胞培养最好不加），放置于4℃冰箱中保藏待用；

3.细胞培养使用前培养基应先放入37℃水浴中温浴，提前打开超净台的紫外灯杀菌，然后从水浴锅中取出培养基，喷上70%酒精后放入超净台中待用；

4.从液氮中取出冻存管，立刻放入37℃的水浴锅中晃动，直至细胞冻存液完全溶解；

5.将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5mL培养液，轻轻吹打混匀；

7.向细胞沉淀内再加入适量培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养皿中进行培养。

8.取出在培养箱中培养的细胞（一般BMSCs传代3次左右就不太好了，所以较难培养）显微镜下观察细胞的生长状态，在超净台中吸去表面的培养基，此时加入少量的培养基清洗一下，然后向培养基内加入1-2 ml 0.05%胰蛋白

酶后放入37℃培养箱中处理1-2分钟使细胞与培养皿脱离。

9.取出培养皿，观察胰酶处理的效果，一般以视野中出现均匀的单细胞为宜，如果有多个细胞聚集的现象可以继续处理1-2分钟，然后吸去胰酶，加入适量的培养基进行终止胰蛋白酶活性，用电子移液器套移液管进行吹打，使细胞悬浮。

10.显微镜下观察细胞悬浮程度，最好是可以看到均匀的单细胞，如果有多个细胞聚集的现象可以用手动移液器进行吹打。

11.向事先准备好的培养皿中加入8-9ml的培养基（此过程加入的培养基的量与加入细胞时所带入的培养基的量有关），一般10cm的平板中总量有10ml的培养基。向含有培养基的培养皿中加入1-2ml的细胞悬液，然后放入细胞培养箱内

1.加入FBS血清时要考虑血清本身的体积，使FBS血清的终浓度达到10%；

2.FBS血清和二抗生素提前1天放入4℃的冰箱中融化，可以用50mL无菌的离心管分装，以免多次融化造成血清变性。每50mL的离心管中最多装入40-45mL的FBS血清，因为血清冻存后会膨胀；

3.冻存管中的细胞溶化过程要迅速，减少DMSO对细胞的破坏作用；

动物细胞培养、计数、冷冻和复苏

由于本次实验分三天进行，日期分别为10月31日（周一）、11月2日（周三）、11月4日（周五），实验内容分别为动物细胞培养、结束，动物细胞冷冻以及最后的动物细胞的复苏，又因为冷冻和复苏可视为连续环节，故本报告分成两个部分来记录本次实验，具体内容如下：

I.动物细胞的培养和计数

一、实验目的由动物细胞表达和合成的蛋白质除了具有正确的氨基酸序列之外，在加工过程中还能以正确的方式进行折叠和修饰，且大多能以天然形式分泌到培养基中，从而确保了所生产的蛋白质具有与天然产物一致的生物活性、免疫原性和体内寿命，这些特点使得动物细胞成为工业化生产诊断和治疗用生物产品的理想宿主，如各类重组蛋白质和单克隆抗体等。另外，目前方兴未艾的组织工程、干细胞工程等也是和细胞培养技术密切相关的，因此，可以说细胞培养技术是细胞工程、组织工程等研究领域的基础。

本实验的目的是让学生学习和了解动物细胞培养的基本操作，以及相关的细胞培养前准备工作、细胞培养的环境条件和其他有关注意事项；用血球计数板对培养瓶中的细胞进行计数以及用台盼蓝计细胞的存活率。

动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体的细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术，是动物细胞工程的基础。

体外培养可分为原代培养和传代培养，原代培养是指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，原代细胞通常只能培养10－50代左右即退化死亡；由原代细胞通过变异、分化等手段筛选出来具有无限次代培养能力的细胞群称为细胞系，这类细胞的培养称为传代培养。

体外培养的细胞根据其生长方式，主要可分为贴附型细胞和非贴附型细胞两类，贴附型细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长，非贴附型细胞可在培养液中悬浮生长，因而也叫悬浮型细胞。

动物细胞培养与微生物培养有很大不同，这主要是因为动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体表面才能生长。虽然动物细胞培养的基本原理和微生物类似，但动物细胞对于营养的要求更加苛刻，除氨基酸、维生素盐类、葡萄糖外，通常还需要血清；对于培养环境的适应性也比微生物差，其对环境极其敏感，包括pH、溶解氧、温度、剪切力等都比微生物有更高的要求，培养过程中一般需严格监控；动物细胞生长缓慢，因此培养时间较长，它们对环境的影响又比微生物大，因此常用空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合气体进行供氧和调节pH。

动物细胞培养还需要防治污染问题，细菌、真菌、病毒或细胞均可导致动物细胞培养的污染，而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境都有可能含有污染物。因为动

物细胞的培养周期通常为数天到数周，培养时间较长，因此防治污染问题则更加显得重要。细胞培养过程中需要对细胞生长状态进行监测，这就必须在培养过程中随时取样进行细胞计数。最简单、直接和最经济的方法是用血球计数板计数。计数时取血球计数板四角的四个大方格，每个方格面积为1.0mm2，点样后其厚度为0.1mm，这样每个方格的体积即为1.0×10-4ml，细胞数的计算公式为：

四个大方格总细胞数×稀释倍数×104÷4，单位是细胞数/mL。

细胞存活率或称细胞活性的检测是用台盼蓝染色方法，其原理是活细胞的细胞膜完整，染色剂不能渗入，因而不能被染色，而死细胞的细胞膜不完整，细胞被染上蓝色，存活率为： 活细胞数÷总细胞数×100％。

3.二氧化碳培养箱：设定二氧化碳浓度为5％。

4.培养基：DMEM培养基，除菌过滤；自制无血清培养基，0.22μm滤膜除

5.血清：Hyclone新生小牛血清。

6.PBS缓冲液，0.22μm滤膜除菌过滤。

7.胰酶：溶于PBS缓冲液，浓度0.25％，0.22μm滤膜除菌过滤。

8.玻璃方瓶、5ml和10ml移液管，121℃湿热灭菌，30分钟。

11.台盼蓝染色液：0.4克台盼蓝溶于100ml PBS缓冲液，过滤待用。

1.贴附型细胞传代培养

（1）倒掉将要传代的细胞培养瓶中的培养基；

（2）用10ml无菌PBS洗涤，倒掉；

（3）加入2ml胰酶溶液（0.25％），进行消化；

（4）显微镜下观察，直至所有细胞由铺展状态收缩为圆球形；

（6）按稀释要求加入新鲜培养基，吹打分散，分装入玻璃方瓶，置于二氧化碳培养

按贴附型细胞传代培养步骤（6）操作即可。

（1）将干净的盖玻片覆盖在血球计数板正中央，压紧使它们之间不留空隙；

（2）待计数样品如果需要，用PBS进行稀释；

（3）取0.5ml稀释后的样品，加入0.5ml台盼蓝染色液（0.4％），用滴管轻轻吹打混

（4）用滴管将细胞悬浮液沿盖玻片两侧缓缓滴入血球计数板的两个平台上，直至平

台上完全充满细胞悬浮液，（5）显微镜下计数，并按上述公式计算细胞密度；

通过倒置显微镜的观察计数，得出的结果是，在平台1上四个大方格得到的活细胞总数为206个，死细胞总数为0个，在平台2上四个大方格得到的活细胞总数为210个，死细胞总数为1个。

根据细胞数的计算公式：

四个大方格总细胞数×稀释倍数×104÷4，单位是细胞数/mL。

所以平台1上活细胞比率即细胞存活率为100%，平台2上活细胞比率即细胞存活率为1÷211=0.474%

本次实验根据老师提供的讲义可明显发现几处需要注意的地方：

1.胰酶消化的程度必须掌握好，消化不足则细胞结团，无法分散，这将严重影响传代后细胞的生长，消化过量则会使细胞严重受损；

2.在将细胞悬浮液滴加到血球计数板上时注意不能过量以至于细胞悬浮液溢出平台，同时不能出现气泡；

3.对于稀释比例，应掌握在每个大方格内含25－50个细胞为合适；

4.对于每个大方格中刚好压在边线上的细胞，应当只计入两条边线上的细胞而忽略另两条边线上的细胞，例如将上侧和左侧边线上的细胞计入，那么下边和右边边线上的细胞则不能计入，不论细胞是大半在方格内还是小半在方格内。

稀释实验时，存在不少问题，老师也在事后指出了，因为是垂直式超净工作台，所以在其中进行实验时，要时刻注意需要保持无菌的试剂瓶瓶口位置，不能有遮住瓶口的操作，否则就会有导致染菌的危险，另外，从注意事项2也同时可看出事先没有做好量的粗略估计也可能在实验过程当中造成意外的失误。

计数实验时可能由于对倒置显微镜不太熟练的原因，在计数上花费了不少的时间，这需要在以后的操作实验中不断练习，也同时可能是因为这个原因，计数可能存在一定的偏差，这也必须在今后的实验中注意。另外，从注意事项1和4中，可以看出消化的程度还有计数的方法都将影响到最后的实验结果与准确性，消化的程度更会直接影响细胞的存活率。

II.细胞的冷冻和复苏

一、实验目的细胞在体外长期传代中并不是稳定不变的，它们常常会发生各种变异，表现在形态、生长特性、细胞的结构甚至细胞核型也会发生变异，这些变异往往会导致目标产物的丢失，细胞功能的丧失以及生物安全性方面的问题。因此，在构建好细胞株后需要建立一个细胞库，用低温冷冻的方法将细胞保存起来，以便随时有新鲜的细胞可供使用，确保研究或生产所用的细胞在一定的时间内具有结构和功能的稳定性和一致性。

本实验的目的是让学生学习和了解细胞冻存、复苏的目的和基本操作方法。

在动物细胞的组成成分中90％以上是水，而水在冷冻过程中会形成冰晶，由于动物细胞没有细胞壁，冰晶会使细胞膜发生破裂而导致细胞死亡，因此要维持冷冻和复苏过程中细胞的存活率，必须在冷冻液中加入冷冻保护剂。常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，其中二甲基亚砜因为其对细胞具有良好的保护性和较低的毒副作用二成为首选。

在冷冻和复苏过程中影响细胞存活率的因素主要是保护剂浓度和温度下降速率，实际操作中二甲基亚砜的浓度通常为5－10％，一般来说，冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成；在复苏过程中对细胞产生伤害的原因主要是解冻过程所形成的局部渗透压波动，通常采用的方法是快速解冻。

5.冻存液：10％DMSO＋10％小牛血清＋80％培养液

8.细胞培养操作用具包括方瓶、移液管、培养基等，无菌。

（1）准备好分散良好的细胞悬浮液并用台盼蓝染色计数；

（2）离心并将细胞重新悬浮在冻存液中，使细胞密度达到6×106活细胞/ml；

（3）将细胞分装在冻存管中，每支1ml，旋紧冻存管盖子；

（4）静置30分钟，使冻存液和细胞内的DMSO浓度达到平衡；

（5）将冻存管置于程序降温仪内，设置降温速率1℃/min，－40℃后5℃/min，降温至－

（6）将冻存管置于液氮罐（－196℃），长期保存。

（1）准备好玻璃方瓶、移液管、离心管等（无菌），新鲜培养基；

（2）将冻存管从液氮罐中取出，立即置于40℃水浴中，直至冻存管内细胞悬浮液完全融

解，此过程约1－2分钟；

（3）在超净工作台内将冻存管内细胞悬浮液移至离心管，加入10ml新鲜培养基，离心

倒掉上清液，将细胞重新悬浮于10ml新鲜培养基中，移至玻璃方瓶，置于二氧化碳培养箱。

因为冷冻和复苏的实验没有相关需要记录的数据，所以本部分跳过了实验结果这一节，直接进行讨论。这两次实验的注意事项为：

1.涉及和液氮相关的操作，应戴好防护手套以防冻伤；

2.冻存管盖子必须旋紧，否则液氮容易渗入冻存管内，这样不仅可能导致污染，而且

可能由于老师考虑到实验过程中的危险性，并没有让我们进行有关于液氮的实验操作步骤，但这两项注意还是值得我思考和借鉴的。这两次实验的重点是冷冻过程中温度必须缓慢下降，尽可能减少细胞内冰晶的形成；在复苏过程中采用快速解冻，减少解冻过程所形成的局部渗透压波动对细胞产生伤害。如不注意这两点，会对细胞冻存和复苏后细胞的存活率带来影响。

其实这两次实验的主要内容基本都与垂直超净工作台有关，个人认为老师的用意也是在此，让我们了解实验室中动物细胞不论用在何处，无菌首先是第一位的，因为要考虑到动物细胞的生长周期较长，所以保持无菌操作的必要性就变得尤为重要。

最后，感谢老师提供的讲义，让我们省下不少寻找资料和预习实验的时间，也同时感谢老师一个星期的指导。

那么到底是哪里出了问题呢？其实有时候我们在取样和样本保存的时候，一些细节问题没注意到，那么就会导致整个实验所有的努力白费。特别是一些刚进实验室的熊孩子们，一顿操作猛如虎，一看结果全是哭！

好了，好了，小拓今天就来整理一下，一些常规实验样本保存方法及注意事项，包括：分子实验、蛋白实验、病理实验、透射电镜、生化检测。

一、分子实验（RNA/DNA）