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阿尔茨海默病中β淀粉样前体蛋白羧基端短肽C31与自噬的相关性研究
　　摘要：目的： 对阿尔茨海默病中β淀粉样前体蛋白羧基端短肽C31含有的毒性作用及其与自噬之间的相关性进行研究分析，并且探讨自噬是否可以介导该种物质的清除。方法 ：首先构建C31质粒作为实验组，而且构建VECTOR质粒，将其作为对照组；其次，通过脂质体转染法将其转染到Appsw Hek293细胞系里；然后通过WESTERN BLOT的方法对其表达进行有效验证；再者，对两种质粒应用Mtt法来进行瞬时转染四十八小时后的细胞存活率的检测，各自给予不一样的自噬调节药物，从而对C31和自噬相关蛋白采用WESTERN BLOT方法进行检测；最后，分别采用免疫共沉淀法、免疫荧光检测法对C31和LC3进行检测，分别确定其是否结合、能否共位，从而对自噬是不是介导C31降解的重要途径而进一步验证。结果： 实验组（C31）转染组细胞活力与对照组相比，明显较低（P<0.05）；实验组和对照组的自噬水平没有表现出显著的差异；在采取雷帕霉素与饥饿处理方式以促进自噬的前提下，与没有加药处理的小组相比，LC3-Ⅱ水平较高，只是尚未具有统计学意义；C31水平与空载水平差异相对来说，并未具有统计学意义；3-MA自噬抑制剂的应用使得LC3-Ⅱ水平有些许下降，C31水平得以一定的改变，两者都不具有统计学意义；增加自噬体与NH4Cl、CQ之后，细胞自噬水平得到显著上升，CQ发挥了最显著的作用，C31水平和空载水平相比，显著上升了（P<0.05）。在Sh-Sy5y细胞中得到的结果是相似的，只是C31水平在NH4Cl、CQ作用之后，与空载水平相比，并不具有统计学差异。免疫荧光法检测之后，C31结合于LC3，锚定在自噬体上，从而在自噬代谢这一过程中充当了参与者的角色。结论： 无论是Appsw Hek293细胞系还是Sh-Sy5y细胞系，都具有毒性作用，过表达C31并不会对细胞自噬水平带来改变，自噬能介导C31的清除，自噬也许可以对阿尔茨海默病发挥保护性的作用。 中国论文网 /6/view-6975634.htm　　关键词：C31；阿尔茨海默病；LC3；自噬 　　阿尔茨海默病简称AD，是一种发展比较缓慢的关于记忆、语言、定向以及视空间等方面功能的障碍疾病，在“淀粉样蛋白级联假说”这一AD发病机制存在局限性的情况下，App的C末端剪切短肽C31被提出其在AD中具有一定的毒性作用，并不依赖于Aβ，和AD的发病存在密切关联[1]。而自噬是一种神经系统退行性的疾病，其在AD中发挥的作用越来越受到重视。有关研究发现其能够介导APP-CTF清除，在增加药物处理的情况下，还能使其水平下降[2]。而后来的研究表示出APP-CTF能间接结合于LC3而在自噬情况下发生降解现象。而自噬能否介导C31清除，其在AD中是否有保护性作用，同样是本文的探讨内容。 　　1.材料和方法 　　1.1 一般材料 　　采购Appsw Hek293细胞系、Sh-Sy5y细胞系、Mem/Ebss培养液、Dmem、Opti-mem、胎牛血清、非必需氨基酸、胰酶-Edta混合物、HOECHST 33258、3-MA、G418、NH4Cl、CQ、雷帕霉素、Mtt、LIPO-FECTAMINE2000、PROTEIN G AGAROSE、Bca蛋白测定试剂盒等。 　　1.2 方法 　　1.2.1 两种细胞的培养及其转染 　　（1） Appsw Hek293细胞培养液包括10%胎牛血清、400μg/ml G418、均为1%的双抗以及非必需氨基酸；（2）Sh-Sy5y细胞培养液包括1%双抗、10%胎牛血清。而两种培养液的环境皆为37℃并且含有0.5%二氧化碳的细胞培养箱，以对数生长期细胞为实验对象。 　　1.2.2 构建质粒 　　构建C31质粒作为实验组，构建VECTOR质粒作为对照组。将Appsw Hek293细胞和Sh-Sy5y细胞分别经过胰酶消化后，以3：1的比例转至6孔板对其进行培养，转染的细胞条件为细胞融合长度范围为70%至80%。在转染过夜之后，对各自孔板上的细胞进行处理，将细胞收集起来采用WESTERN BLOT的方法对其表达进行有效验证。 　　1.2.3 细胞活性的Mtt检测 　　对两种质粒应用Mtt法来进行瞬时转染四十八小时后的细胞存活率的检测，各自给予不一样的自噬调节药物，从而对C31和自噬相关蛋白采用WESTERN BLOT方法进行检测。 　　1.2.4 免疫共沉淀与免疫荧光检测 　　分别采用免疫共沉淀法、免疫荧光检测法对C31和LC3进行检测，分别确定其是否结合、能否共位，从而对自噬是不是介导C31降解的重要途径而进一步验证。 　　1.3 数据处理 　　数据均采用SPSS17.0软件进行统计学处理，计数资料都以均值±标准差来表示，t检验比较。p<0.05认为差异具有统计学意义。 　　2.结果 　　C31质粒送测序之后的序列和App695基因序列相比，结果呈现一致性，没有移码或者突变位点，质粒构建成功，转染至Sh-Sy5y细胞系，两天后观察其成功转入并且表达目的的相关蛋白，对其表达水平进行WESTERN BLOT检测。 　　（1）实验组（C31）转染组细胞活力与对照组相比，明显较低（P<0.05）；实验组和对照组的自噬水平没有显著差异。 　　（2）在采取雷帕霉素与饥饿处理方式以促进自噬的前提下，与没有加药处理的小组相比，LC3-Ⅱ水平较高，只是尚未具有统计学意义。 　　（3）C31水平与空载水平差异相对来说，并未具有统计学意义。 　　（4）3-MA自噬抑制剂的应用使得LC3-Ⅱ水平有些许下降，C31水平轻微改变，两者都不具有统计学意义。 　　（5）增加自噬体与NH4Cl、CQ之后，细胞自噬水平得到显著上升，CQ发挥了最显著的作用，C31水平和空载水平相比，显著上升了（P<0.05）。 　　（6）在Sh-Sy5y细胞中得到的结果是相似的，只是C31水平在NH4Cl、CQ作用之后，与空载水平相比，并不具有统计学差异。免疫荧光法检测之后，C31结合于LC3，锚定在自噬体上，从而在自噬代谢这一过程中充当了参与者的角色。 　　3.讨论 　　本研究验证了C31具有的毒性作用，也得到了NH4Cl与CQ对自噬产生的抑制效果的验证。自噬在AD中具有很重要的作用，患者发病早期的受损大脑BECLINL蛋白水平呈现下调趋势，意味着在AD这一时期，自噬是呈现下调状态的。而有研究表明，患者的内侧颞叶皮层神经元的Mtor通路出现上调情况，自噬诱导剂的应用可以对AD的病理与行为学表现提供改善的参考依据。有关研究表示，自噬功能出现失调，会导致神经退行病变的发生，引起AD这一疾病。本研究进行了更进一步的探讨，即C31可以与LC3结合而产生作用，锚定至自噬体上，在自噬代谢过程中充当着参与者的角色[3]。而且也验证了自噬同样是C31分解代谢的参与者。实际上，自噬的降解功能具有一个特点，即选择性。自噬在C31和LC3结合的情况下，有选择性地在C31代谢过程中促进了自噬水平以及C31的分解代谢，使得C31的毒性作用被削减。 　　总之，本文的研究表明，无论是Appsw Hek293细胞系还是Sh-Sy5y细胞系，都具有毒性作用，过表达C31并不会对细胞自噬水平带来改变，自噬能介导C31的清除，自噬也许可以对阿尔茨海默病发挥保护性的作用。 　　参考文献： 　　[1]林仁.阿尔茨海默病转基因小鼠脑Aβ与自噬的变化[D].福建医科大学，2012. 　　[2]侯磊.SORL1基因表达及突变与阿尔茨海默病相关性研究[D].中国人民解放军军医进修学院，2011. 　　[3]范靓丰.Caspr与β-淀粉样前体蛋白在体外相互作用减少了β-淀粉样蛋白的产生[D].苏州大学，2013.
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自噬标志蛋白LC3与大鼠寿命的相关研究
目的:观察SD大鼠在不同饮食限制喂养方式下的细胞自噬程度及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达,分析大鼠的自然寿命及其生存曲线,探讨LC3与大鼠寿命的相关性,以期明确细胞自噬呈高活性是否利于寿命的延长。　　
方法:购买24月龄健康SD大鼠45只,随机均分成三组:第Ⅰ组为对照组即正常饮食组,第Ⅱ组为一日喂养一日禁食组,第Ⅲ组为五日进食两日禁食组。不同饮食限制方式饲养三月后采集标本。以透射电子显微镜法观察细胞自噬现象,比较各个组大鼠肝脏细胞自噬泡占胞浆总面积的比值；Westernblot检测大鼠肝脏组织自噬标志蛋白LC3的表达,分析细胞的自噬活性；观察老龄大鼠的自然寿命及生存时间,比较不同组别的大鼠LC3的表达及发生自噬的程度和差异,绘制生存曲线,进行关联性分析。　　
结果:(1)与第Ⅰ组比较,第Ⅱ组和第Ⅲ组大鼠肝脏细胞自噬泡占胞浆总面积的比值增高,差异均有统计学意义(P0.05)。(2)Westernblot结果显示:第Ⅰ组的LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值较低,第Ⅱ组和第Ⅲ组LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值较第Ⅰ组有明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),第Ⅱ组和第Ⅲ组之间LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值无明显差异。(3)分析三组生存曲线,与第Ⅰ组比较,第Ⅱ组和第Ⅲ组生存率增高,差异有统计学意义(P0.05)。(4)对细胞自噬活性和大鼠生存时间的关联性分析结果为rs=0.861,表明细胞自噬活性和大鼠生存时间之间呈线性正相关。　　
结论:(1)两种饮食限制方式均增强大鼠肝脏细胞自噬,但增强自噬的程度无明显差异。(2)LC3呈高表达与大鼠寿命延长密切相关。(3)细胞自噬与寿命延长密切相关。
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Death toll is only less than AIDS, ranked second in a single infectious disease. Very big impact on the Ankang. Studies have shown that heparin combined with hemagglutinin (HEP a bindinghemagglutinin adhesin HBHA is a) is one of the Mycobacterium tuberculosis most important adhesion molecules, molecular weight of 28 kDa important expressed in the bacteria outside, combined with heparin and vulcanized dextran [2]. It has three functions of tectonic domain, but its role in bacterial adhesion with detailed invasion of alveolar epithelial cells in the process of the unknown. Alveolar type II epithelial cells are a group of cells with alveolar cover activity, but also can be broken down and excreted active agents and cytokines [3], in the course of natural immune system to display the main conditioning. And our research group in the previous research shows that after the Mycobacterium tuberculosis infected with alveolar type II epithelial cell line A549 cell line, can perhaps restraint of A549 cells autophagy effect and adhesion of Mycobacterium tuberculosis in prime HBHA protein can perhaps restraint LC3 gene expression, most likely the obstacles in A549 cells by autophagy effect by the elimination of Mycobacterium tuberculosis. To further illustrate the mechanism of HBHA protein restraint LC3 expression effect, and the resulting increase TB infected effect, separation, the research group decomposition of the full-length recombinant HBHA fragment, C terminal missing fragment and the N terminus of the missing pieces, and separation effect in type II alveolar epithelial cell line A549 cell line, indecent observes the autophagy related gene expression changes, and cytokine release spectrum. Thereby it is proved preliminarily that HBHA protein of MTB infected with alveolar type II epithelial cells in the immune adjustment action effect, discuss its action mechanism. A detailed study of the following: 1, HBHA protein purification, extraction and autophagy in A549 cells coherent gene and BCG contamination effects affect the study of has retained in full-length fragments of bacteria of the recombinant HBHA protein, C terminal is missing off fragments and N terminal of the missing pieces stop expression, purification and extraction. Stop SDS gel electrophoresis protein accuracy and purity of affirmation. Application of this protein fragment separation effect on A549 cells. By Western blot validated the expression of LC3 and ATG5 interference and to preliminarily that HBHA protein restrain A549 cell autophagy signal pathway. Inventions, egg white can restraint LC3 expression, but in fact do not incompetent pre ATG5 expression remind HBHA protein means not affect the composition of atg12 ATG5 complexes, can restrain LC3 complexes, thus restrain A549 cell autophagy cover effect. To validate autophagy and A549 cells to resist the action between infected with Mycobacterium tuberculosis, this study using BCG affect A549 cells with recombinant HBHA full-length fragments and C terminal is missing off fragments and N-terminal missing fragments separation in conjunction with BCG infected A549 cells compared. To detect the release of LDH. The results show that significant increase in the amount of LDH in the release of protein. After the restraint of autophagy, cell elimination of MTb to reduce, to weaken the role of protection. To further confirm the HBHA protein in MTB infected A549 cells effect. The test and application of BCG and HBHA antibody with effect of A549 cells and detection of LDH release. The results showed that the LDH release of the antibody group was significantly decreased compared with the BCG infected A549 cell group. Explained the close HBHA protein using an antibody, MTB on A549 cell damage action is abate, suppose the HBHA antibody in MTB invasion have certain protection effect of A549 cells in the process of. 2, detection HBHA protein affect the cells after cytokine excretion HBHA protein restrained autophagy at the same time, can get involved in the inflammatory response? The research and application of recombinant HBHA protein affect A549 cells. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) detecting the proinflammatory cytokines IL 1 beta, IL 6 and IL 10, TNF alpha and IFN gamma, inventions A549 cells to excretion of IL 1 beta, IL 6 and IL 10, TNF alpha and IFN gamma five cytokines. The recombinant HBHA feature, fault can enhance the A549 cell excretion IL 1 beta, IL 6 and TNF alpha and IFN a gamma, and on the excretion of IL 10 did not affect. Is this research shows, HBHA protein through the action of the focus of alpha helical structure, restraint of the LC3 expression, and mature, which restrained autophagy, whereas anti HBHA antibody can offset this effect. At the same time, HBHA can cause the release of inflammatory factor IL 1 beta, INF gamma. So as to remind, MTb in the process of HBHA contamination has a major role, is a major virulence factor MTb bacteria contamination, spread and cause inflammatory response.目录:缩略语表5-7中文摘要7-10Abstract10-12前言13-15文献回顾15-30&&&&一、结核病流行的现状15&&&&二、MTb的病原体相关分子模式15-19&&&&三、HBHA 蛋白研究现状19-24&&&&四、结核分枝杆菌与肺泡 II型上皮细胞相互作用24-25&&&&五、上皮细胞自噬作用的研究现状25-27&&&&六、细胞因子在免疫应答中的作用27-30第一部分 HBHA蛋白提取并对A549细胞自噬相关基因以及BCG感染效应的影响30-51&&&&引言30-31&&&&1 实验材料31-36&&&&2 试验方法36-43&&&&3 实验结果43-48&&&&4 讨论48-51第二部分 HBHA 蛋白对 A549 细胞炎性因子释放的影响51-58&&&&前言51&&&&1 实验材料51&&&&2 实验方法51-53&&&&3 实验结果53-55&&&&4 讨论55-58小结58-59参考文献59-65个人简历和研究成果65-66致谢66分享到：相关文献|您的位置：&
>实验课题之：细胞自噬的研究方法
实验课题之：细胞自噬的研究方法
提供者：上海劲马实验设备有限公司 &&发布时间：&&阅读次数：203次&&
&正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：&一、自噬诱导剂&(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激&(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）&(3) Earle＇s平衡盐溶液：制造饥饿&(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂&(5) Rapamycin：mTOR抑制剂&(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂&二、自噬抑制剂&(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂&(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂&(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：ysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）&&除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。三、自噬过程进行观察和检测细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：&1、观察自噬体的形成&由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状&结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）&2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成&由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧&光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。&3、利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成&自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。&（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）&4、检测长寿蛋白的批量降解：非特异&5、MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。&6、CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。&四、自噬相关蛋白的定位在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：&Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。&LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。&pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。&MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。&Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。&Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔&（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理。）
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