这是小钱的第 129篇分享今天小钱分享的话题是：PCR；LAMP；RPA；重组酶；单链DNA结合蛋白;Bsu DNA聚合酶；Taq DNA聚合酶；Bst DNA 聚合酶1 1. PCR变温扩增技术和等温扩增技术1.1 主流核酸检测技术比较恒温扩增技术凭借其快速、高效、高灵敏的优点，开始被大家拿来和PCR比较，并且可以实现更多场景的应用。恒温扩增的技术有很多如LAMP、RPA、RCA、CPA、SDA和HDA。今天我们挑选市面上最多的两种（RPA和LAMP），和PCR技术做一个清晰的比较【1】。图1.1 三种代表扩增技术比较1.2主流核酸检测技术的原理1.2.1PCR技术原理图图1.2.1PCR技术原理关于PCR的原理，可以学习往期文章——PCR原理知识学习视频：【科普】PCR原理详细介绍1.2.2LAMP技术原理图图1.2.2LAMP技术原理图环介导等温扩增(LAMP)是Notomi等于2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，其原理主要是基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，包括1对外引物、1对环状引物和1对内引物，3种特异引物依靠链置换BstDNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。反应后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料判断扩增情况。此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，共3个阶段。原理视频：【科普】LAMP等温扩增原理1.2.3RPA技术原理图图1.2.3RPA技术原理图重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。在这个体系中，由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。原理视频：【培训】RPA等温扩增技术在核酸检测中的应用2 2. 三种扩增技术酶组分的区别2.1（PCR）Taq DNA聚合酶Taq DNA 聚合酶属于聚合酶家族 A，是一个单体酶，它与大肠杆菌聚合酶 I（pol I）具有很高的结构相似性。1995 年，Kim 等公布了 Taq DNA 聚合酶的晶体结构，为解释其耐热性、催化活性及分子改造奠定了基础，其结构特点如图2.1。图2.1 Taq DNA聚合酶的三维结构Taq DNA聚合酶是从水生噬热杆菌(Thermus aquaticus)中提取获得的热稳定DNA聚合酶，可以DNA作为模板合成DNA。因其出色的热稳定性，可结合温度循环变换过程，在体外完成DNA的复制。目前体外诊断试剂常用具有热启动(Hot start)功能的Taq DNA聚合酶，该类酶通过修饰抑制其在低温条件下的活性，防止其在未达到预设温度时出现非特异性扩增，只有在温度升高后，解除抑制，才释放酶活性，从而进入PCR循环扩增过程。常用的TaqDNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、抗体修饰和配体修饰。2.2（LAMP）Bst DNA聚合酶不同于PCR反应需要反复的热变性以解开DNA双链，在应用上依赖于高质量的热循环仪。自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的DNA等温扩增技术，其中相当一部分是利用链置换反应解开DNA双链模板。链置换反应是指某些DNA聚合酶在延伸新链的过程中如果遇到下游DNA链，可以继续延伸反应并同时将下游双链剥离而产生游离的单链。它已被用于包括链置换扩增、滚环扩增、多重置换扩增、环介导的等温扩增等多种体外等温扩增技术。根据其基本原理将它们分为缺口依赖和引物依赖的链置换反应。其中LAMP体系，常用的链置换DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶，这种酶具有5'→3' DNA聚合酶活性，不具有3'→5'和5'→3'的核酸外切酶活性。Bst DNA Polymerase具有很强的链置换(strand displacement)能力，可应用于核酸的等温扩增反应，如环介导的等温扩增和滚环扩增等。2.3（RPA）相关酶RPA技术是一种多酶协作的反应体系。2.3.1重组酶重组酶可与引物结合形成复合体，定位至与引物同源的靶序列，促使引物与模板结合，同时帮助DNA解链，以便启动扩增；2.3.2单链DNA结合蛋白(SSB)单链DNA结合蛋白可与被置换出的DNA单链结合，稳定单链结构；2.3.3Bsu DNA聚合酶Bsu DNA聚合酶也是链置换DNA聚合酶的一种，主要应用于RPA重组酶扩增。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列；一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应，Bsu DNA聚合酶启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。End声明--文章如有侵权部分，请联系作者删除；--文章仅是小钱的技术学习分享，关于相关技术保密权归属原作者；--文章不可用作任何商业用途；--谢绝转载；参考[1]https://magigen.biomart.cn/news/3009334.htm往期推荐体外诊断试剂的注册、研发过程、体考分子诊断创新技术液滴微流控芯片微流控器官芯片核酸等温扩增技术和微流控芯片便携式核酸快速检测技术医用微流控芯片学习分子诊断与微流控技术PCR定量与微流控技术更多精彩进入聊天对话框或服务项，点击“知识点”和“工作话题”，可以学习更多哦~您如果觉得文章对您或身边朋友们有帮助的，就点个关注和分享呗，很高兴认识您……码上有“小钱”}

1985年，美国PE2cetus公司人类遗传研究室的Mullis等人发明了体外无限扩增核酸片段的聚合酶链式反应，即PCR技术。目前，PCR技术已在众多的研究领域得到广泛应用，如在基因克隆，基因定点突变，c DNA文库构建，基因测序，载体构建以及人类基因组计划等方面发挥着重要作用。一、原理介绍聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，特点是能将微量的DNA大幅增加。原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。聚合酶链式反应由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经95℃高温时变性成单链；②模板DNA与引物的退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55-60℃时，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：当温度调至72℃时、DNA模板-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环三个过程就可获得更多的复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需3分钟左右，2小时左右就能将目的基因扩增放大几百万拷贝。二、实验步骤1. 准备材料和试剂灭菌的200ul 离心管、依次加入5 μl Taq缓冲液（10×），5 μl dNTP，2.5 μl引物1（10pmol/ μl），2.5 μl引物2（10pmol/μl），1~10 ng模板DNA，无菌水水补至50 μl。2. 混匀以上溶液放置 PCR 扩增仪中。 3. 设置PCR循环参数，一般为：变性 94 ℃30~40s，退火55 ℃ 1min ，延伸72 ℃1.5~2min，循环次数为30~35次，反应结束10℃保存。4. 琼脂糖凝胶电泳，反应结束后，取1/5体积的反应液进行0.8%~2%电泳，检测目的片段。PCR 产物特异性差，是由于 模板DNA 的复杂度不同，PCR的结果会有些差异。如用核 DNA 作模板即可能产生多条带扩增。这时也可采用一些方法将非特异性产物减至最少。一般可提高退火温度，必要时退火温度升至 65 ℃
，引物延伸温度降至 65 ℃
，使三温度变化 PCR 变成两温度变化 PCR。也可减少引物量，或者减少体系Taq DNA聚合酶含量，还可减少退火和引物延伸的时间，以解决非特异性的扩增。此外，如果改变了Taq 缓冲液中Mg2+浓度（一般降低Mg2+浓度），也可有助于提高 PCR 扩增的特异性。5. PCR体系分析：由靶序列模板、耐热DNA聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸盐（dNTPs）、正反向引物、反应缓冲液、二价阳离子等组成。很多公司销售PCR Mix，即除模板和引物外，其他所需成分均已混合优化至最佳配比，广泛适用于各种模板、引物。1）模板模板可以是单链或双链DNA等。如果模板是mRNA，需反转录得到cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。常用的模板：①基因组DNA。试剂盒提取细胞基因组DNA可以直接使用，无需纯化。②粗提DNA。应避免混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制药及能结合DNA的蛋白质。③纯化的DNA，由于去除了抑制PCR反应的杂质，可提高扩增成功率。PCR 反应所需DNA模板的量极微，依DNA的性质而定，不到 1 μg
的基因组DNA序列，就足以进行PCR分析；对于质粒克隆的DNA，一般用纳克（ng）量；对于染色体DNA，一般要到微克（μg）级。PCR甚至可以从1个DNA分子扩增特定的DNA序列。对不同实验的具体用量，可以通过实验具体确定。常规PCR mix的推荐模板量类型哺乳动物基因组DNA（1 μg含有3×105 个DNA分子）大肠杆菌基因组DNA（1 μg含有2×108 个DNA分子）质粒cDNA模板量管家基因等高拷贝基因10 ng即可，复杂模板10 ng~500 ng。100pg~1ng~1pg取决于目的序列拷贝数。通常建议cDNA模板稀释10~100倍再PCR 2）引物引物是影响扩增效率和扩增特异性的关键因素，引物好坏也直接影响扩增是否成功。引物设计有两个主要考虑因素：特异性和扩增效率。特异性是由错配的频率决定的，特异性差的引物易产生错误的扩增产物。扩增效率是指引物以每循环增加两倍扩增产物达到理论最优的能力。引物设计的一般原则：引物长度引物的最佳长度为24或25个碱基左右。但是如果需要调整Tm值，引物的长度可以控制在21至28个碱基之间。当扩增≥10 kb长片段时，25~35个碱基之间的引物可以提供更好的结果。引物过短，会降低产物的特异性，每增加一个核苷酸，引物特异性可以提高 4 倍。引物过长，会使退火过程不完全，与模板结合不充分，以至引起扩增产物的明显减少。引物末端引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；引物 3’端应避免出现发夹结构。引物G+C含量引物的GC含量控制在40%-60%之间。Tm值引物额外附加序列，即与模板非互配对序列，不应参与引物 Tm 的值计算；正向引物和反向引物的Tm值相差不超过5℃为佳，Tm值调整至55℃~65℃为佳。碱基的分布引物 A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域；避免连续出现4个及以上的相同碱基，或者某两个核苷酸连续重复出现（例如，ACCCC或ATATATAT；引物内部或者两条引物之间避免有5个碱基以上的互补序列；两条引物的 3’端避免有3个碱基以上的互补序列。序列特异性引物设计完毕请使用 NCBI BLAST功能检索引物特异性，以避免非特异性扩增产生。注意： PCR的产量通常取决于PCR引物的3’端，引物间形成二聚体会降低扩增效率。引物合成与保存：设计好序列交由公司合成，OPC或PAGE纯化，以减少非特异扩增和信号强度的降低，冻干引物于-20 ℃可以保存12~24个月，甚至更长；液体状态引物于-20 ℃可以保存6个月左右。一般用无菌水将引物配成高浓度的储备液（如100 μmol/L）。引物浓度：一般在0.2~1 μmol/L范围内，浓度偏高会导致非特异性产物堆积和错配，同时能增加引物之间形成引物二聚体的概率，非特异性产物和引物二聚体与产物竞争使用酶、dNTPs和引物，结果导致目的产物产量降低。商业合成的引物一般以OD值计算，其有关量值可用以下近似方法计算：引物中每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5，则一条20个碱基的引物分子量为20×324.5=6490，而1OD相当于 30 μg
的引物。如果得到一管5OD的 25 mol/L
的引物，其质量数为5 × 30=150 μg/L，摩尔数=150/6490= 23 nmol/L，若加去离子水 400 μl 溶解，则浓度为23 nmol/400 ul=57 μl/L 。3）dNTP工作浓度为20~200 μmol，四种 dNTPs 应当等量。如 dNTPs 浓度过高，则加快反应速度，造成非靶位置启动和延伸时核苷酸的错误掺入以及增加室验成本，而且当 dNTP 浓度高于50 mmol/L时，还会抑制 Taq 酶的活性，如 dNTPs 过低，反应速度下降，但可提高实验的精确性。在具体操作中，需根据实验具体情况，确定最适的 dNTPs 的浓度。在标记探针及测序等特殊 PCR中，其中的某一种脱氧核苷酸还可被标记核苷酸所替代。dNTPs可与 Mg2+ 结合，应注意 Mg2+ 浓度与 dNTPs 浓度之间的关系，Mg2+浓度比 dNTPs 浓度高0.2~2.5 mmol/L。4）缓冲液反应缓冲液需含有Tris、KC1、MgCl2、牛血清白蛋白等。10~50 mmol/L Tris-CI （pH 8.4）：作用是维持 Taq 酶作用环境的偏碱性。25~50 mmol/L KCI：作用是促进引物退火，浓度高于50mmol会抑制Taq酶的活性。1.5~2.0 mmol/L MgCl2：Taq酶具有Mg2+依赖性，Mg2+浓度会显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。100 μg/ml 牛血清白蛋白（BSA）：对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用。参考文献：PCR技术在DNA片段扩增的应用与意义}