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磁粒子成像(MPI)小动物活体成像系统
厂家: 布鲁克磁共振事业部(Bruker Magnetic Resonance)
磁粒子成像(MPI)系统是面向临床前成像的崭新技术。作为适用于疾病研究、移植研究和药物研制的配套临床前成像技术,新增的磁粒子成像很有可能帮助研究人员从器官、细胞和分子层面,对病程产生新的深刻认识。全新布鲁克临床前MPI扫描仪是与飞利浦电子公司合作开发的。合作中双方各展所长,布鲁克发挥了其在磁共振分析仪器和临床前磁共振成像(MRI)领域的领先优势,而飞利浦则充分运用了其在医疗成像领域的优势。磁粒子成像是一项由飞利浦公司科学家发明并发展的新型医疗成像技术,其可行性论证于2005年首次在《自然》杂志上发表。MPI断层扫描成像技术通过探测注入血液循环中的磁性氧化铁纳米颗粒,来生成三维图像。这项技术用于医疗和工业研究以及最终用于治疗患者的潜力,业已在若干研究中得到证明,譬如,MPI技术已经被用于生成实时图像,精确捕捉了小鼠心血管系统活动情况。事实上,这种在短短数毫秒之内采集高时间分辨率图像的能力,为旨在利用时间分辨率来解决令许多现有成像技术束手无策的问题的创新应用奠定了基础。品牌: 布鲁克/Bruker
型号: MPI
价格: 300万 - 500万元
电话: 400-889-7796
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质谱成像技术概念及质谱成像方法介绍
现代生物学研究已经不再停留在仅从组织中识别一种特殊的化学成分,或者蛋白成分上了,我们需要精确的了解这些物质是如何分布,如何构成的,解答这些问题需要更进一步的实验技术,比如免疫组化或免疫荧光检测方法,但是这些技术需要特殊的抗体,而且效率低,偏差大。  因此研究人员将目光转向了质谱技术上,以质谱为基础的成像方法不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子,可在组织切片中找到每一种蛋白质分子,并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息,而事先无需知道所检测蛋白的信息,不需要对待测物进行标记,分析物可以其最初的形态被检测,同时可对这些蛋白质分子含量进行相对定量,适用于研究生物分子的反应。  质谱成像(ImagingMassSpectrometry,IMS)这种最新原位分析技术主要是利用质谱直接扫描生物样品,分析分子在细胞或组织中的“结构、空间与时间分布”信息。其基本流程(以质谱分析生物组织标记物为例)见下:  简单而言,质谱成像技术就是借助于质谱的方法,再配套上专门的质谱成像软件控制下,使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。但是随着这项技术的不断发展,也陆续出现了许多针对各种问题的新技术。  最早的质谱成像技术是基质辅助激光解吸电离(MALDI,matrixassistedlaserdesorptionionization)质谱分子成像技术,由范德堡大学(VanderbiltUniversity)的RichardCaprioli等在1997年提出,他们通过将MALDI质谱离子扫描技术与专业图像处理软件结合,直接分析生物组织切片,产生任意指定质荷比(m/z)化合物的二维离子密度图,对组织中化合物的组成、相对丰度及分布情况进行高通量、全面、快速的分析,可通过所获得的潜在的生物标志物的空间分布以及目标组织中候选药物的分布信息,来进行生物标志物的发现和化合物的监控。  正如数字图像包括三个通道:红、绿、蓝一样(单个亮度定义了每个像素的颜色),质谱成像也包含了数以千计的通道,每一个对应于一个特殊的光谱峰值,“你可以通过质谱方法从这些像素中获得任何信号,然后调整图像中所需分子像素的相对亮度,最后得到一张分子特异性的成像图。”  这种方法可用于小分子代谢物、药物化合物、脂质和蛋白,而且质谱成像能相对快速的利用许多分子通道,完全无需特殊抗体。下面列出五种先进的质谱成像方法。  I.挑战高分子量蛋白——MALDI质谱分子成像技术  在对组织或生物体进行成像,分析小分子构成的时候,有一个“拦路虎”总是阻碍实验的进程,那就是多肽,这些多肽体积十分大,要想对它们进行分子成像几乎是不可能的,比如想要研究肿瘤边缘的分子微环境,如果直接成像是不可能获得清晰图像的。  来自范德堡大学的质谱方法专家RichardCaprioli博士因此发明了基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱分子成像技术,这项技术不局限于特异的一种或者几种蛋白质分子,它可在组织切片中找到每一种蛋白质分子,并提供这些蛋白质分子在组织中的空间分布的精确信息,而事先无需知道所检测蛋白的信息,同时可对这些蛋白质分子含量进行相对定量。  MALDI质谱分子成像是在专门的质谱成像软件控制下,使用一台通过测定质荷比来分析生物分子的标准分子量的质谱仪来完成的。被用来研究的组织首先经过冰冻切片来获得极薄的组织片,接着用基质封闭组织切片并将切片置入质谱仪的靶上。通过计算机屏幕观察样品,利用MALDI系统的质谱成像软件,选择拟成像部分,首先定义图像的尺寸,根据尺寸大小将图像均分为若干点组成的二维点阵,来确定激光点轰击的间距。激光束通过这个光栅图案照射到靶盘上的组织切片,软件控制开始采集质谱数据,在质谱仪中,激光束对组织切片进行连续的扫描,组织样品在激光束的激发下释放出的分子被质谱仪所鉴定从而获得样品上每个点的质荷比(m/z)信息,然后将各个点的分子量信息转化为照片上的像素点。在每个点上,所有质谱数据经平均化处理获得一幅代表该区域内化合物分布情况的完整质谱图。仪器逐步采集组织切片的质谱数据,最后得到具有空间信息的整套组织切片的质谱数据。这样就可以完成对组织样品的“分子成像”。设定m/z的范围,即可确定该组织区域所含生物分子的种类,并选定峰高或者峰面积来代表生物分子的相对丰度。图像中的彩色斑点代表化合物的定位,每个斑点颜色的深浅与激光在每一个点或像素上检测到的信号大小相关。  通过增加单位面积上轰击的激光点数量和像素,研究人员可以获得更多的样品信息,例如采用4000像素比200像素能够得到更好的样品图像。质谱分子成像技术是一种半定量或相对定量技术,图像上颜色深的部分表明有更多的生物分子聚集在组织的这个部分。然而,不可能据此确定生物分子在组织的不同部位的实际绝对含量。选择组织图像上的任意一个斑点,图像都能够给出一个质谱谱图或者离子谱图,代表在组织的该部位存在这种生物分子,然后与做指纹图谱类似,像做指纹图谱那样,将样品的离子谱图与已知标准品进行对照,分析差异,从而进行生物标志物的发现和药物作用的监控。  Ⅱ.无需样品处理实时成像——电喷雾电离技术  一般质谱成像方法由于体积庞大,重量重,需要冗长的样品准备阶段,因此并不适用于即时成像(bedsideapplications),比如说要帮助外科医生进行实时的肿瘤边界成像监控,那么就要寻找新的方法了。  一种称为电喷雾电离技术(desorptionelectrosprayionization,DESI)的MS成像技术解决了这个问题。DESI技术于2004年首次提出,由于这一方法具有样品无需前处理就可以在常压条件下,从各种载物表面直接分析固相或凝固相样品等优势而得到了迅速的发展。  这种方法的原理是带电液滴蒸发,液滴变小,液滴表面相斥的静电荷密度增大。当液滴蒸发到某一程度,液滴表面的库仑斥力使液滴爆炸。产生的小带电液滴继续此过程。随着液滴的水分子逐渐蒸发,就可获得自由徘徊的质子化和去质子化的蛋白分子DESI与另外一种离子源:SIMS(二次离子质谱)有些相似,只是前者能在大气压下游离化,发明这项技术的普渡大学Cooks博士认为DESI方法其实就是一种抽取方法,即利用快速带电可溶微粒(比如水或者乙腈acetonitrile)进行离子化,然后冲击样品,获得分析物的方法。  DESI系列产品最大的优势就在于无需样品处理,一般质谱和高效液相色谱分析,样品必须经过特殊的分离流程才能够进行分析检测,使得一次样品检测常常需要约一个小时,而DESI系列产品可将固体样品直接送入质谱,溶液被喷射到检测表面,促使样品离子均匀分布。采用这一手段的质谱分离过程,只需3分钟左右即可完成。  Ⅲ.活体成像——APIRMALDI/LAESI技术  了解细胞的内部成分是理解健康细胞不同于病变细胞的关键。但是直到目前为止,唯一的方法是观察单个细胞的内部,然后将其从动物或植物中移除,或者改变细胞的生存环境。但是这么做的话,会使细胞发生变化。科学家还不是很清楚一个细胞在病变时与健康细胞的差别,或者当它们从一个环境移到另一个环境中产生的变化。  来自华盛顿大学AkosVertes教授希望能从另外一个方面来进行活细胞分析,在他的一项关于活叶样品中初级和次级代谢产物分布的研究中,研究人员发现叶片中积累基质很厚,常导致光谱末端低分子量部分模糊,而且基质辅助激光解析电离(MALDI)质谱分析需要在真空中进行,但活体样本在真空中无法存活。  实际上,MALDI质谱分析的原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,致使基质和分析物膨胀并进入气相。而生物样品也可以直接吸收能量的,比如2.94mm波长的光能激活水中氢氧键。  因此Vertes等人想到复合两种技术来解决这一问题。首先他们利用大气压红外线(anatmosphericpressureinfrared,APIR)MALDI激光直接激活组织中的水分,使样品气化,就像是组织表面发生了细胞大小的核爆炸,从而获得了离子化微粒,进入质谱中进行分析。但是并不是所有的气化微粒都带电,大部分其实是不带电的,会被APIRMALDI遗漏。  为了捕捉这些中性粒子,Vertes等人采用了第二种方法:LAESI(laserablationelectrosprayionization,激光烧蚀电喷雾电离),这种方法能捕捉大量带电微滴的微粒,然后重新电离化。通过对整个样品进行处理,复合这两种方法,就能覆盖更多的分子,分析质量更高。  与一般质谱成像过程不同,Verte的方法还在成像中增加了高度,从而实现了3D代谢物成像。这项技术的分辨率是直径10mm,高度30mm,这与生物天然的立体像素相吻合,这样科学家们就可以获得天然构像。  Ⅳ.3D成像——二次离子质谱技术  质谱成像技术能将基质辅助激光解吸电离质谱的离子扫描与图像重建技术结合,直接分析生物组织切片,产生任意质荷比(m/z)化合物的二维或三维分布图。其中三维成像图是由获得的质谱数据,通过质谱数据分析处理软件自动标峰,并生成该切片的全部峰值列表文件,然后成像软件读取峰值列表文件,给出每个质荷比在全部质谱图中的命中次数,再根据峰值列表文件对应的点阵坐标绘出该峰的分布图。  但是一般的质谱成像技术不能对一些携带大分子碎片的化学成分进行成像,来自宾夕法尼亚州州立大学的NicholasWinograd教授改进了一种称为二次离子质谱(SIMS,secondaryionmassspectrometry)的方法,可以对样品进行完整扫描,三维成像。  SIMS早在用于生物学研究之前就已经应用广泛了,比如分析集成电路(integratedcircuits)中的化学成分,这种质谱技术是表面分析的有利工具,能检测出微小区域内的微量成分,具有能进行杂质深度剖析和各种元素在微区范围内同位素丰度比的测量能力。  这种技术具有几个优点:速度快(-10,000spectrapersecond),亚细胞构造分辨率(-100nm),以及不需要基质。但是另外一方面,不同于MALDI方法,SIMS方面不是一种“软”技术,这种方法只能对小分子成像,因此常常需要进行粉碎。  Winograd教授改进了这一方法,他利用了一种新型SIMS光束(carbon-60磁性球),这种新光束比传统的SIMS光束对物体的化学损伤更小。C60同时撞击样品表面,类似于“一阵爆炸”,这样重复的轰击使得研究人员能深入样品,进行三维分子成像,Winograd教授称这个过程是“分子深度成像”(moleculardepthprofiling)。  C60的能量与其它的离子束相当,却不到达样品表面以下,这样样品可以连续地被逐层剥离,研究人员就可以得到纵面图形,最终获得三维的分子影像。Winograd教授等人用含有肽的糖溶液将硅的薄片包裹起来并进行SIMS实验,随着薄膜逐渐被C60剥蚀,可以获得糖和肽的稳态信号。最终,薄膜完全剥离后就可以获得硅的信号。如果用其它的射线或原子离子代替C60,粒子束会快速穿过肽膜而无法提供有关生物分子的信息。因此这种方法具有良好的空间分辨率,能够获得巨噬细胞和星型细胞的细胞特征和分析物的分布情况。  这里还要说到一点,SIMS和上一技术(APIRMALDI/LAESI技术)都可以对三维成像,但两者也有差别,SIMS方法中,采用高能离子轰击样品,逐出分析物离子(二级离子),离子再进入质量分析器。MALDI方法则用激光辐射样品使之离子化,另外SIMS探针可以探测到100nm的深度,能提供纳米级的分辨率,而MALDI可以探测更深,但空间分辨率较低。  Ⅴ.高灵敏度高分辨率——纳米结构启动质谱技术  质谱在检测生物分子方面有很大潜力,但现有方法仍存在一些缺陷,灵敏度不够高和需要基质分子促使分析对象发生离子化就是其中之二。比如说,需要溶解或者固定在基质上的方法检测代谢物,较易错判,因为这些代谢物与那些基质常常看上去都一样。另外基于固定物基质的系统也不允许研究人员精确的判断出样品中某一分子到底来自于哪儿。  来自斯克利普斯研究院的GarySiuzdak博士发明了一种称为纳米结构启动质谱(nanostructure-initiatormassspectrometry,NIMS)的新技术,这种技术能以极高的灵敏度分析非常小的区域,从而允许对肽阵列、血液、尿和单个细胞进行分析,而且还能用于组织成像。  NIMS利用了一种特制的表面,这种多孔硅表面上聚集了一种含氟聚合物,这些分子在受到激光或离子束照射时会猛烈爆发,这种爆发释放出离子化的分析物分子,它们被吸收到表面上,使其能够被检测到。这种方法利用激光或离子束来从纳米尺度的小囊中气化材料,从而克服了一般质谱方法缺少所需的灵敏度和需要基质分子促使分析对象发生离子化的缺陷。  通过这种方法可以分析很多类型的小分子,比如脂质,糖类,以及类固醇,虽然每一种分析材料需要的含氟聚合物有少许差别,但是这是一种一步法的方法,比MALDI简单多了——后者需要固定组织,并添加基质。  由于含氟聚合物不能很好的离子化,因此会发生轻微的光谱干扰,而且由于离子化过程是“软性”的——就像MALDI,所以NIMS产生的生物分子是整块离子化,而不是片段离子化。不过这种技术对于完整蛋白的检测灵敏度没有MALDI高。
测试服务限时免费开启----拉曼光谱成像/光电流成像/荧光寿命成像
测试服务限时免费开启----拉曼光谱成像/光电流成像/荧光寿命成像产品简介NanobaseXperRamC紧凑型共聚焦拉曼光谱仪采用高于竞争对手30%效率的透射式光栅和高效率的自研CCD,可实现超高灵敏度。不同于传统的拉曼光谱设备采用平台移动的方式,它选择的独特的振镜扫描技术,保持位移平台不动,通过振镜调节激光聚焦的位置完成扫描成像,不仅速度快、扫描面积大,且精度也高。产品配置显微镜反射LED照明,右手控制的机械x-y载物台,物镜10×/20×/40×/50×/100×(选配),进口正置型显微镜扫描模块扫描模式:振镜扫描,分辨率:扫描区域:200um×200um(40x物镜下)激光器532nm(蕞大100mW,可调DPSS激光器)滤波器低波数低至70cm-1光谱仪焦长35mm光谱范围蕞大8150cm-1光谱分辨率低至3个波数检测器TE制冷CCD,1932×1452pixels,4.54umwidth光栅光栅刻线光谱范围分辨率2400lpmm70~2340cm-13cm-11800lpmm70~3400cm-14.4cm-11200lpmm70~5000cm-16.4cm-1600lpmm70~8150cm-19.8cm-1其他选配项ND功率控制衰减片光电流源表、探针台实现光电流mapping偏振控制目前我们针对XperRam系列光谱仪推出以下限时免费测试项目限时时间:2022.6.1-2022.12.31申请条件:微信朋友圈转发公众号文章,获取10个赞,并截图发给联系人即可享受测试项目测试内容测试条件激发波长探测器水平拉曼测试拉曼光谱、二维拉曼成像成像范围:200um×200um(40×物镜下),空间分辨率:激发波长:532nm/785nm,光谱分辨率:0.12nm2000×256pixels,15μm像素宽度(iVAC316,Andor)PL测试PL光谱、PL二维成像激发波长:405nm/532nmTCSPC测试瞬态荧光寿命曲线、二维荧光寿命成像激发波长:405nm系统响应度:<200ps测量范围12.5ns-32us光电流测试I-V曲线、I-t曲线、二维光电流成像激发波长:405nm,532nm,785nmSemishare高精度探针台Keithley2400源表蕞大电压源/量程:200v测量分辨率:1pA/100nV设备优势1、拉曼光谱分析不同浓度的环境干扰物,体现了低浓度样本中仪器检测的高灵敏度。2、拉曼成像分析二维材料MoS2的分布3、拉曼测量硅片:透射式体光栅VPH和少量光学元件可以实现高通量和高S/N信噪比典型应用介绍拉曼光谱在宝石鉴定中的应用在1200cm-1~3600cm-1区间,没有明显的峰值出现,说明其中没有环氧树脂或有机染料等基团,是chun天然宝石。1123cm-1、1611cm-1是环氧树脂中苯环特有的峰,因此属于被环氧树脂或其他胶填充裂纹的改善翡翠。拉曼光谱在二维材料中的应用G峰和G、峰强度之比常被用来作为石墨烯层数的判断依据,G峰强度随层数增加逐渐变大;G、峰的半峰宽随层数增加逐渐变大,且往高波数蓝移。拉曼光谱在植物研究中的应用不同浓度的胡萝卜素的拉曼成像图中红色和绿色区域分别代表高浓度和低浓度的羰基。在Control样品中,绿色区域连续分布在粉末中,表明淀粉在微胶囊内部和外部的分散相对均匀。在掺入海藻糖后,在微胶囊的外部周围检测到含有高浓度和低浓度羰基的混合区域。该结果证实了海藻糖和淀粉由于其亲水性而在微胶囊中具有良好的相容性。拉曼光谱在光波导中的应用光波导主要通过对折射率的调控来实现,折射率分布影响导波性能。光刻过程材料吸收能量发生热膨胀,导致应力变化、晶格破坏和化学键键长变长,从而使拉曼位移发生变化。拉曼光谱在催化中的应用——原位升温拉曼Ag/CeO2在不同温度和气氛中的原位拉曼光谱。目前我司的光电测试系统已在国内外各个高校均有服务,欢迎各位老师同学前去调研。关于昊量光电昊量光电您的光电超市!上海昊量光电设备有限公司致力于引进国外先进性与创新性的光电技术与可靠产品!与来自美国、欧洲、日本等众多知名光电产品制造商建立了紧密的合作关系。代理品牌均处于相关领域的发展前沿,产品包括各类激光器、光电调制器、光学测量设备、精密光学元件等,所涉足的领域涵盖了材料加工、光通讯、生物医疗、科学研究、国防及前沿的细分市场比如为量子光学、生物显微、物联传感、精密加工、先进激光制造等。我们的技术支持团队可以为国内前沿科研与工业领域提供完整的设备安装,培训,硬件开发,软件开发,系统集成等优质服务,助力中国智造与中国创造!为客户提供适合的产品和提供完善的服务是我们始终秉承的理念!
质谱成像:MALDI技术在质谱成像中的应用
一、质谱成像技术简介  成像质谱(IMS)是一种非常灵敏的分子成像技术,可提供组合的分子信息和空间分辨率。它允许从组织切片、单细胞或其他物质表面直接鉴定和定位化合物分子。成像质谱研究的核心特点是质谱仪的高灵敏度、技术的无标签性、对肽和蛋白质的成像能力,以及从个体水平(几百微米)到细胞水平(几十纳米)空间分辨率。成像质谱允许在单个实验中同时检测数千个不同分子的图像。因此,它是一种有效的多组分分子成像技术。科学家们已经开发了许多不同的成像质谱方案和仪器来研究生物内源性化合物,如脂质、肽和蛋白质,以及外源化合物,如聚合物,或者用于研究组织处理药物的分布。这些研究提供了从亚细胞层次到有机体层次生物过程的详细情况。  当今,成像质谱主要是用于病理学离体组织研究的技术,并不具备MRI(磁共振成像)或PET(正电子发射断层摄影)扫描的体内诊断能力。然而,它可以作为体内成像的补充技术来验证生物分子的分布代谢规律或不同疾病阶段药物的递送方式。许多研究人员正在探究用这种补充成像方式来解决分子分布的具体问题。这种做法的理由很明显。没有其他单一的成像技术能够以适当的空间分辨率、时间分辨率及生物学状态提供分子结构和解剖信息的适当组合。与其他分子成像方法相比,如MRI,PET或免疫组织化学(IHC),成像质谱有一个独特的特征:它可以使化合物分子可视化而又无需标记,这可以实现其他技术所不能实现的对新化合物分布规律的研究。通常,它是在使用影响色差的常规染色剂(例如通常用于组织染色的苏木精和曙红(H&E)情况下,可以做化合物分子鉴定的唯一工具。它可以用于常规组织学染色剂不可实现的化合物分子分布规律的研究。这是因为在病理学中使用的常规染色剂只提供一般组织分型,而不识别特定分子,不提供分子修饰及其组合信息等。不能被常见组织染色剂染色的几种药物和代谢物如表1所列。  二、质谱成像的解吸和电离技术  IMS需要从被研究物质的表面解离和离子化化合物分子。主要有两种物理方法:(1)用载能带电粒子碰撞分析物表面,(2)用来自脉冲相干光源的光子照射表面。  1.带电粒子的解吸和电离  带电粒子主要用于二次离子质谱(SIMS)成像。在这种方法中,分析物表面暴露于高能聚焦的一次离子束下。离子撞击会导致表面上下分子的级联碰撞,从而引起表面分子的移动和电离。随后,碰撞产生的二次离子可以进入质量分析器分析以确定其性质。碰撞能量通常会保持较低,以确保一次离子可以与不同区域表面分子相作用,并且确保已碰撞区域不再进行二次碰撞分析。低于表面层分析碰撞能量的实验被称为静态SIMS实验。高于该碰撞能量的实验,被称为动态SIMS实验。在动态SIMS实验过程中,分析物表面会发生持续的变化。在静态SIMS实验中,被分析的表面通常在1%以内。  在SIMS实验过程中,大量的内部能量被转移到表面分子中。这会导致表层化合物分子产生大量的碎裂。这使得该方法不适合直接研究大分子物质,如肽和蛋白质等。该方法可以较好地观测待测物表面元素和小分子化合物分布规律。化合物碎裂模式与电子碰撞电离中观察到的碎裂模式相似。  最常用的一次离子种类是铟和镓。它们主要应用于半导体表面上的元素和有机杂质研究,以及薄层表面涂层的研究。受益于较大簇离子或分子离子的应用,切片组织等生物表面也可以被分析。较大的一次离子有Aun+、Binm+、C60+等。这些离子可以使完整次级分子离子的产率更高,并且减少了分子离子碎裂。此外,这些离子的应用还可以显著降低对表面下层分子的破坏,从而增加三维成像实验成功的可能性。  所有的SIMS实验与以上所述的离子光束均需要保持真空环境,否则初级离子会因为平均自由程太短而不能到达分析物表面。解吸电喷雾电离(DESI)是大气压下的解吸和电离技术。它会产生电喷雾液滴,然后在大气条件下被传送到待分析物表面。溶剂液滴吸附到表面分子上,从而产生与常规电喷雾质谱电离相似的二次离子。这种方式可以产生带多电荷的准分子离子。据报道,该方法适用于多种待测物的表面分析,包括药物片剂、血迹和组织切片等。研究显示,DESI技术用于组织成像可以可视化观察脑和肿瘤组织切片中的磷脂和脂质。  2.光子解吸、电离  2.1LDI和MALDI  能够从表面解离和电离分子的第二种方法是光子与表面分子产生相互作用。通常,脉冲激光束聚焦在分析物表面上。由表面层吸收的光子能量会导致表面材料的爆炸性去除或消融。  当使用红外(IR)或可见光时,光子能量主要转化为表面振转能量。在紫外线或真空紫外线(VUV)光下,光子能量增加可以引发大量的电子激发。如果积累在待分析化合物分子中的内部能量足以引起直接电离,该过程被称为激光解吸和电离(LDI),如图1(a)所示。在激光解吸过程中积累的内部能量通常比较高,表面分子可以发生大量的碎裂。此外,有机化合物的低电离效率使得该技术不太适合于大分子质谱分析。这些情况下,可以应用激光解吸后电离(LDPI)策略来电离解吸过程中产生的中性粒子(图1(b))。后电离策略可以在真空条件下通过UV或VUV波长范围内的二次能量激光束照射实现。最近研究表明,激光解吸可以有效地与ESI离子源联用,从而在大气压力条件下可以进行激光烧蚀电喷雾电离(LAESI)(图1(c))。这种组合增加了可以用激光解吸策略分析的化合物类别,并能减少化合物碎裂。当与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)组合时,激光烧蚀可以成功地用于待测品表面元素的定量分析。烧蚀的组分被等离子体源雾化并离子化成构成元素和同位素离子,随后通过质谱仪进行分析。当与光发射光谱法结合时,使用从ICP发射的光可以获得更多定量基本信息。  由于存在大量碎裂,直接LDI策略不适用于分子量超过500Da的生物大分子分析。这时可以选择使用能量调节基质。分析物混合或被涂布在待分析物表面上(参见图1(d))可以克服这个限制。在20世纪80年代晚期,由Karas和Hillenkamp构想的这种技术被称为基质辅助激光解吸和电离(MALDI)。它是现代蛋白质组学研究中的关键技术,可以应用于生物大分子,如蛋白质和DNA分子的解吸和电离。在复杂待测物表面的MALDI分析中,基质辅助方案有更多的用途。  首先,应用基质后,它可以将复合物样品中的待测分子重构在基质晶体中间或者表面。这些分析物掺杂基质晶体的形成,可以将待分析物与其他辅助因子如盐等分离,并可以将大分子分散在基质中。用脉冲激光对晶体表面的后续照射能够快速地使样品过热。这是作为激光能量强吸收体的基体受到电子激发(UV-MALDI)或振动激发(IR-MALDI)作用的直接结果。协同运动的过热基质与其夹带的分析物可以被引导到的真空中。这有助于分析物分子气相化的非破坏性转变。基质的最后一个目的是通过电荷转移促进分析物分子的电离。该方法通常会使[M+X]+型的阳离子转化成完整的准分子离子,其中X表示产生的阳离子的类型。最常见的阳离子是氢、钠和钾。为保证分析成功,分析物分子必须与固体基质材料共结晶,并且这些基质应该是过量的。最常用的基质与分子的比例在103:1至105:1的范围内。根据经验,研究的分析物的质量越高,完全解吸所需的基质剩余越多。  2.2MALDI在敞开环境中的应用  近来敞开式解吸策略的发展已经产生了一些进步,该策略也需要使用基质。类似于LAESI方法,其基质、分析物混合物需要在基材上共结晶,这样可以有更多完整样品从表面移除。MALDI离子会受质谱入口和样品表面之间电场的作用而发生偏转。从MALDI基质上产生的中性粒子含有大量在真空MALDI实验中丢失的分析物分子。它们可以被吸附在尚未完全雾化的电喷雾液滴表面。接下来是常规的产生多电荷离子的电喷雾电离过程。该过程又缩写MALDESI(基质辅助激光解吸电喷雾电离),它可以将MALDI在敞开环境中的优点以及电喷雾电离的灵敏性结合起来。  2.3MALDI和液相色谱  MALDI技术和液相色谱(LC)分离技术的成功联用,提高了复杂混合物的分离检测效率。分析复杂混合物时,MALDI会受到显著的离子抑制。不同物化性质的化合物分子共存通常会导致一种或几种组分优先于其他组分离子化。离子抑制效应是许多分析学科量化研究的主要障碍。对MALDI质谱强度差异的解释本质上是定性的。克服该问题的一个方法是进行色谱分离以降低混合物的复杂性。许多nano-LC-MALDI方法已经实现了将分离时间尺度转换为空间分布尺度。自动点样技术可以将一系列二维纳升液相洗脱液滴(通常每滴为150纳升)沉积到MALDI基质预涂层上。也可以采用其他方法将基质溶液与LC洗脱液混合,并将该混合物液滴有序沉积在干净的基质靶板上用于质谱分析。  3.SIMS中基质的使用  使用能量调节基质材料的优点并非仅限于光子解吸和电离技术。MALDI质谱技术的成功使MALDI基质在SIMS(二次粒子质谱分析法)样品制备中的应用成为可能。分析物与MALDI基质(2,5-二羟基苯甲酸/DHB)的共结晶,更加方便了采用基质增强型SIMS(ME-SIMS)方法对质量超过10kDa的大分子离子进行检测。因此,这种仅基于SIMS电离方法产生完整大分子离子(肽,蛋白质,寡核苷酸)的技术是成功的。有人提出,基质在ME-SIMS中的作用与在MALDI中的作用相似:都是为分析物分子提供了一个嵌套环境,并提供了质子来增强电离。以DHB为基质可以获得最佳结果,可能解释是DHB提高了样品表面区域中分析物的浓度。由于ME-SIMS(与MALDI相比)仅检测表面50nm之内,所以分析物的定位在样品制备中至关重要。分析物分子必须存在于晶体的表面,因为在静态SIMS条件下不能检测到基质共结晶的较深层次。  三、成像质谱的空间分辨率  IMS的一个关键参数是可实现的空间分辨率。空间分辨率决定细胞和组织表面可观察到的细节。获得质量分辨率图像的最常见方法是使用微探针或扫描模式。微探针模式质谱成像通过SIMS扫描样品上的电离探针束或移动样品通过MALDI对焦进行。对于每个特定位置,带电离子束与样品相互作用,存储坐标,并获得位置相关离子产生的质谱数据。以这种方式构建光栅,光栅中的每个点都具有与其相关联的质谱数据。使用专用软件,可以从这些数据集中构建质量分辨的离子图像。微探针成像实验中最大的可实现空间分辨率由微探针的尺寸决定。在技术上,光栅中每个点的精度是控制分辨率的另一个因素,但是对于SIMS和MALDI成像,通常这不是一个问题。此外,实验实现的空间分辨率受样品制备(基质)和灵敏度(信噪比)相关因素的影响。  1.二次离子质谱(SIMS)和解吸电喷雾电离质谱(DESI)成像质谱的空间分辨率  SIMS使用离子源的大多是由液体金属离子枪构成。Ga+和In+主要用于表面元素和小分子分析。使用这些枪可以获得的空间分辨率由发射器的大小,离子柱中的静电光学元件和主光束电流决定。后者通常保持较低以防止光束的空间电荷膨胀和分辨率损失。当在低电流下进行调谐时,这两支枪可以提供50nm的焦点。金属簇光束Aun+、Bin+以及C60+可以在非常低的光束电流下提供100-200nm的光斑尺寸。低光束电流通常需要更长的实验时间。因此,为了应用更大的束电流增加分析速度,空间分辨率通常会受到一定损失并减小到大约1μm。DESI使用指向表面的带电溶剂液滴喷射流。喷射流与表面的润湿相互作用中,作用区域大小决定了空间分辨率。研究表明,DESI成像的常规空间分辨率为1mm左右。  2.激光直接成像(LDI)和基质辅助激光解析电离(MALDI)成像质谱的空间分辨率  聚焦激光束的分辨率是波长决定的,并受阿贝衍射极限的限制。长波长的红外激光器难以聚焦在50μm以下。商业仪器中的UV激光光斑的物理尺寸限制在约10μm。在商业仪器上,大多数实验用激光光斑尺寸在50和250μm之间。这个选择是由灵敏度和完成实验所需的时间决定的。特殊的共焦目标可以将斑点尺寸减小到1μm,但是使用MALDI的这些小斑点所需的激光阈值通量对于组织中化合物的无损分析是不是太高仍存在实质性的争论。初步实验显示了其从分析物获取高分辨率图像的能力。替代方法是使用常规MALDI-ToF仪器的过采样方法增加空间分辨率。在这种方法中,激光探针点的移动增量小于光点直径。所有样品在第一个采样点完成后,每个采样增量都会从比激光焦点尺寸小得多的区域采集信息,从而达到增加空间分辨率的目的。这种方法的两个缺点是有限的质谱串联可能性和较大的总样品消耗量。  四、成像质谱仪:发展和改进领域  使用上一节描述的解吸和电离技术,可以在复杂表面产生原子和分子离子。质谱图像的产生需要对这些产生的离子进行后续质量分析。现代质谱方法提供了一系列质量分析仪器来达到此目的。本文介绍三种类型的质量分析仪器,为生物表面的MALDI或SIMS质谱成像提供独特的分析能力。  1.飞行时间成像质谱法  IMS中最常用的质量分析器是飞行时间分析仪。它需要产生脉冲离子,这一要求理想地与MALDI和SIMS要求兼容。所有离子都具有相同的加速电位。相同质荷比的离子将在其解吸过程产生的初始动能之上获得相同的动能。因此,它们的速度取决于它们的质荷比,并且离子可以通过在无场区域中的漂移而分离。离子检测是通过多通道板(MCP)类的粒子检测器实现的。ToF分析提供了非常宽的质量范围,该范围仅受大分子物质检测灵敏度的限制。MALDI-ToF-MS最多可以对数百万道尔顿的分子进行分析。微秒范围内的高传输效率和总飞行时间,为使用高重复率激光器进行高灵敏度表面检测提供了可能性。这使得高通量分析成为可能,而高通量分析正是大表面积样品分析的关键要求。分辨能力的提高可以通过补偿解吸过程产生的初始动能来实现。使用延迟提取,半球形静电扇形器件和反射镜等技术可以在m/z1000下将半峰宽(FWHM)质量分辨率增加到m/△m=30000。用于化合物鉴定的串联质谱通常通过碰撞诱导解离(CID)或通过观察电离后亚稳离子的衰变实现。为此,两个独立的ToF系统可以以所谓的ToF/ToF配置串联。第一个ToF用于前体选择,第二个ToF用于产物离子分析。  2.傅里叶变换离子回旋共振质谱法  傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR-MS)是一种离子捕获技术,它决定了强磁场中潘宁离子阱中捕获离子的回旋加速频率。在外部离子源产生离子后,离子被转移到潘宁离子阱中,直到进一步分析。使用宽带射频电激发,所有离子被激发到大的回旋加速轨道。它们的轨道半径不仅增加,而在潘宁离子阱中,相同质荷比的离子也相互连贯地在轨道绕行。在绕行期间,它们可以在一组双检测电极中引起振荡图像电荷。该时域信号被数字化并进行傅里叶变换以产生回旋加速频谱。质谱图可以通过对回旋加速器方程w=qB/m校准产生。  FT-ICR-MS的主要优点是具有无与伦比的质量分辨率和质量测量精度,可用于从MALDI图像分析中发现新的结构细节。此外,使用捕获离子技术不仅允许CID,而且允许红外多光子解离(IRMPD)和电子捕获解离用于串联质谱的结构测定。分析速度受观测时域信号的长度和相关质量分辨率的限制。质量分辨率取决于轨道离子的相干时间。典型的分析时间是每像素1s,与所用的离子源无关。可以通过增加磁场强度来降低相同分辨率下的瞬态长度。MALDI组织成像实验可以在FT-ICR-MS系统上进行,FWHM分辨率范围从40000到400000。(图2)。  3.MALDI离子迁移成像质谱法  通过MALDI生成离子的迁移分离,质谱图中可以得到更多附加信息。离子迁移谱是基于离子通过碰撞横截面面积的分离技术。在离子迁移质谱中,有充气的漂移池用于质谱分析之前的离子分离,这些离子由于构象或组成变化而具有不同碰撞截面。当用于质谱成像时,除了空间维度和质谱维度之外,还增加了时间漂移的气相分离维度。离子迁移光谱法在两个主要方面有利于MALDI成像质谱的研究。首先,增加额外的分离维度能够检测到更多的质谱峰。离子迁移有利于减小质谱分析复杂度,并有助于不同种类化合物的分离,例如肽和磷脂。第二,质量与漂移时间选择结合使得等压肽或其它类似物分解为分裂谱。  离子迁移、MALDI与用于IMS的ToF-MS组合,能够通过其相关的消化肽片段定位和鉴定蛋白质。离子迁移分离可以鉴定通过常规MALDI-ToF-MS无法鉴定的等压离子。与传统的MALDI-ToF相比,该方法每次测量的观察峰数量增加,能够产生质量和时间选择的离子图像,同时可以对单个离子进行鉴定。图3所示结果证明了离子迁移飞行时间成像质谱(IM-ToF-IMS)对来自组织的蛋白质鉴定的可行性。  组织消化与MALDI-IM-ToF-IMS方法相结合,可以对不同种类组织蛋白质鉴定实行“自下向上”的策略。  五、MALDI成像策略  1.质谱成像流程  不同解吸电离方法与不同质量分析器组合,为在单个组织样品上进行互补实验提供了可能性。  需要仔细的实验设计来确保获得相关的互补分子图像信息。图4中显示的实验工作流程提供了从单个组织生成六个补充图像数据集的示例。在该示例中,通过外科手术获得一块组织。组织中的细胞表达荧光标记的蛋白质,因此成像工作流程中的步骤是产生荧光图像。这提供了一种特定蛋白质的详细位置。在将衬底表面上的10-20μm薄片进行组织切片和安装之后,进行SIMS分析。这提供了在高空间分辨率下的低分子量成像MS数据。静态SIMS除去表面材料的不到1%,因此残留的表面仍然可以进一步分析。SIMS研究完成后,可以用基质涂层覆盖组织表面(参见“基质涂层”一节)。根据感兴趣的分析物,表面可以或不能被洗涤。洗涤方案对所得结果有重要影响。在图4的实验工作流程中,在基质沉积之前不进行洗涤以允许小的水溶性分子成像。在基质沉积后,进行的第一次分析是ME-SIMS。再次只有少量化合物分子从表面去除,晶体表面保持可用于后续的MALDI分析。ME-SIMS数据集提供了更大的完整有机分子(如脂质和分子量小于2000Da的小信号分子)的信息。进行的下一个分析是具有略高于解吸阈值的激光注量的MALDI-ToF分析。MALDI-ToF数据集包含有关内源性肽和完整蛋白的信息(取决于使用的洗涤方案和基质)。可以获得的最后一个MS成像数据集是MALDI-FTICR-MS数据集(或离子迁移率图像数据集)。这些技术需要去除大多数基质材料。它们可以提供高质量分辨率和质量精度信息,有助于识别构成图像的分子。任何残留的基质材料都可以从多次分析的表面上洗去,以便进行最终的H&E染色。这提供了其他的组织学信息,可以与成像质谱数据集结合来鉴定特定区域或组织类型。  2.基体涂层  在MALDI和ME-SIMS分析之前,必须将基质溶液涂布于组织表面。基质溶液由有机溶剂如甲醇或乙腈组成,添加剂为弱有机酸如芥子酸(SA)或2,5-二羟基苯甲酸(DHB)和三氟乙酸(TFA)。加入TFA可增加分子的离子化质子的量。基质应用方法将强烈影响成像MS结果。应用方法将对灵敏度,表面扩散与空间完整性,空间分辨率,表面平坦度和分析速度产生影响。组织性质和环境参数影响组织中蛋白质的提取效率和基质的结晶。因此,控制基质沉积环境也是很重要。有几个实验室正在考虑创新的沉积方法,如基质升华。对于一般实验室,一般有两种基质沉积方法:点样和喷涂。  2.1基质点样  将基质溶液点样到组织部分时需要将分析物的扩散限制在斑点大小范围。已经开发了两种基质检测方法:手动或自动检测。手动点样产生微滴液滴,经常用于不需要生成图像的MALDI组织分析。自动点样使用更小的体积(pl)液滴,并产生约120-150μm的点样尺寸和约200μm的最小分辨率。两种不同类型的自动识别器用于基质沉积:喷墨式压电喷嘴和使用聚焦声波的液滴分配器。两个喷射器都可以释放100μl在组织上干燥成150μm直径的液滴。在这种情况下,成像MS分析的分辨率通常会受到大于分析光束直径的基质点样点的限制。  2.2基质喷涂  基质喷涂使均匀小滴的基质溶液覆盖了样品的整个表面。气动、振动喷头或电喷雾可以使基质溶液变生液滴喷雾。喷涂可以手动和自动化的方式进行。手动喷涂采用手持气动喷枪或TLC喷雾器。通过喷雾装置与x-y机器人联用可以实现自动喷雾应用,也可以在较大的区域上进行基质沉积。使用振动喷雾器在较小的区域也可实现自动喷涂,其小型腔室主要控制湿度。喷涂后形成的晶体通常为10-20μm。为了获得更小的晶体,可以使用电喷雾,减小敏感度产生甚至小于1μm的晶体。当使用喷雾沉积时,激光束的直径限制了MALDI成像质谱的空间分辨率。  3.鉴定策略  用于产生分子图像的质谱峰的识别是所有质谱图像策略中的关键步骤。选择时候,可以使用高质量分辨率以及准确的质量进行测量。通常需要结合其他策略,如使用MALDI串联质谱或其他分析策略来识别表面化合物种类。  3.1MALDI串联质谱法  串联质谱使用是识别表面产生的不同化合物离子的合理选择。限制因素是前体离子选择的分辨率、裂解效率和方法灵敏度。在相同的位置,通常只能进行几个质谱实验。可以在单个位置进行的实验数量仍然取决于提供信号的激光照射的数量。在相邻位置执行串联实验的隔行扫描成像方法可部分克服此问题。一旦裂解模式已知,可以应用多重反应监测来确定化合物分布。  4.LC-MS/MS鉴定  研究可以使用互补组织匀浆和提取来产生组织成分的信息库。也可以使用LC-MALDI来解决混合物复杂性的问题,增加灵敏度,以及降低离子抑制效应。  在直接MALDI成像实验中观察到的MALDI图谱比较分析可以用作识别策略的一部分。在这些研究中,串联MS可用于识别在LC-MALDI靶上发现的各个化合物成分。参考文献:TheDevelopmentofImagingMassSpectrometry.MALDITechniquesinMassSpectrometryImaging.
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