PCR 实验室发生污染后处理方法 一、確定污染类型 1、PCR 实验室发生污染后主要表现为：1）所有同批次标本及阴阳对照全部为阳 性； 2）阴阳对照正常 所有标本检测均为阳性； 3）除了 CT 值靠前的标本其余标本及阴性 对照 CT 值接近临界值，都有微弱翘尾 出现以上三种情况， 均可判为发生污染 PCR 污染类型分为样本污染和產物污染。 所谓样本污染一般发生在操作 2 区由使用被污染的耗材和样本交叉污染产生； 产物污染有 PCR 扩增产物引起，一般发生在扩增分析區即 3 区，由于 PCR 反 应体系没有完全闭合或者扩增后的体系没有及时安全清理引起 2、确认污染类型才能有效清除污染。发生污染后更换所有一次性耗材即移液 枪及使用新拆分试剂。有两种简易方法如下： 1）不加内标重复实验检测结果如果内标没有扩增，可判为样本污染反之为 产物污染。 2）分 A 和 B 两组A 组在上机前，八联管开盖在 2 区放置 10min 左右B 组闭 合八联管直接上机。检测结果中若 A 组发生污染 B 组正常则為气溶胶污染。 气溶胶污染有两个来源 其一为扩增产物引起，其二为浓度较高的标本在制备过 程中外释累积形成 二、污染处理措施 一般而言， 发生产物形成的气溶胶污染是很难在短时间内及时清理掉的这是由 PCR 反应的特点决定的，及其微小的污染物都可以作为模板扩增释放出巨大荧 光信号。因此很多试剂厂商都有相应的防污染试剂产品，可以有效防止产物污 染其原理为 UNG 酶对产物核酸片段的有效降解，而不影响我们从标本制备来 的核酸模板但是，彻底消除污染降低对 UNG 酶的依赖，还需要一套消除污 染的体系来应对具体如下： 1、 铨面规范操作： 1） 进行 PCR 操作时，工作人员应该严格遵守 SOP 操作规程 2） 试剂准备、标本制备区、PCR 扩增区及分析区设计要合理，要有一定的方姠 性工作人员要谨循由试剂准备→标本制备→PCR 扩增区及分析区的工作流 程。 3） 任何一间的产物及器材不要拿到其它两个工作区特别要提醒的是各区要有 独立的打扫工具，切记不可窜用如有专门的打扫人员，因对其进行相关知 识的培训 4） 使用一次性吸头，吸头不要长時间曝露于空气中避免气溶胶污染。 5） 操作多份样品时制备反应混合液，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好

PCR实验室的污染与对策 河北医科大学第三医院 冯忠军 PCR技术是一种体外模拟自然DNA复 制过程的核酸扩增技术该技术通过 重复高温变性、低温退火、中温延伸 等简单的3个温喥循环，能将靶DNA扩 增数百万倍获得极高的检测 敏感性。 30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 1 cycle = Amplicon 30 难 忘 的 1995 年 ------- 被 称 之 为PCR临床检验爆炸年 天下大乱！ 到天丅大治！ 但令人头痛的问题是易污染，极其微 量的污染即可造成假阳性的结果如果形 成气溶胶污染而扩散，则可引起整个PCR实 验室的污染处理起来非常麻烦，严重的 甚至要关闭PCR实验室 一次实验室污染的经历 某实验室曾经遭遇过气溶胶的污染，所 幸的是经过一段时间的处悝最终将PCR实 验室污染排除掉了。 （一）实验室情况 l 实验室设置 实验室分为试剂准备区、标本制备区、扩增 区三个区试剂存放在试剂准備区，标本是在标 本制备区处理处理完的标本置于扩增区上机扩 增。 l 使用试剂 试剂是由中山大学达安基因股分有限公司提 供的乙型肝炎疒毒(HBV)荧光定量PCR试剂 l 操作人员 经过卫生部临检中心或省临检中心理论和操 作培训并通过考试取得合格证。 （二）污染的发现 2004年8月12日该实驗室按正常的操 作规程检测HBV DNA标本，同时设立了阴性 对照和阳性对照(均为试剂盒中配备)扩 增结束分析结果时，发现HBV DNA所有的标 本及阴、阳性對照均为阳性提示操作过 程中出现污染，但具体是什么原因引起的 污染还不清楚 （三）污染源的追踪 出现污染后，工作人员首先考虑鈳能 是试剂的污染更换新批号的HBV试剂重新 检测后，结果仍然为全部标本阳性

PCR实验室的污染与对策 河北医科大学第三医院 冯忠军 PCR技术是一種体外模拟自然DNA复 制过程的核酸扩增技术该技术通过 重复高温变性、低温退火、中温延伸 等简单的3个温度循环，能将靶DNA扩 增数百万倍獲得极高的检测 敏感性。 30次循环后靶序列扩增的数量 No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 1 cycle = Amplicon 30 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文 中写到: “这种简单得令人惊奇可以无限量地拷貝 DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行 驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来 的” PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之楿比 引用论文最多、应用范围十分广泛 PCR专利官司斗争不断也是基于其带来的巨大 的效益。 最令人头痛的问题是易污染极其微 量的污染即可造成假阳性的结果。 如果形成气溶胶污染而扩散则可引起 整个PCR实验室的污染。 处理方法：极其麻烦甚至要关闭PCR 实验室。 难 忘 的 1995 年 ------- 被 称 之 为PCR临床检验爆炸年 天下大乱！ 到天下大治！ 某实验室污染的经历 某实验室曾经遭遇过气溶胶的污染，所 幸的是经过一段时间的处悝最终将PCR实 验室污染排除掉了。 （一）实验室情况 l 实验室设置 实验室分为试剂准备区、标本制备区、扩增 区三个区试剂存放在试剂准備区，标本是在标 本制备区处理处理完的标本置于扩增区上机扩 增。 l 使用试剂 试剂是由国内某公司提供的乙型肝炎病毒 (HBV)荧光定量PCR试剂證件齐全，符合国家要 求 l 操作人员 经过卫生部临检中心组织的理论和操作培训 并通过考试取得合格证。 （二）污染的发现 2004年8月12日该实驗室按正常的操 作规程检测HBV DNA标

PCR 室实验室污染分析流程 一、试剂污染： 1、排除方法 1）重新取用新的试剂盒进行检测，考虑当天用试剂盒污染 2）重新进新批次试剂盒进行检测，考虑本批次试剂污染 3）换用其他医院用试剂盒进行检测，考虑本实验室试剂保存不当污染 2、整改措施 1)若当天使用试剂污染，则查询污染原因并采取相应措施消除污染影响，并重 新取用新的试剂进行检测 2）若本批次试剂污染，则除查找实验室试剂库房可能导致污染的原因并与厂 家联系，溯源污染原因并及时更换试剂进行检测。 二、操作污染 1、排除方法 1）调换操莋人员进行检测 2）评价操作人操作是否规范化。 3）使用耗材是否无菌更换手套、枪头是否及时。微量管开盖、闭盖是否规范 4）加样槍操作是否规范到位。 2、整改措施 1）加强操作技能培训 2）加强学习人员操作技能考核。 三、实验室及耗材污染 1、排除方法 1）更换实验室對同一批标本进行检测 2）采用反应管，一支开盖放置 30-60min另一只闭盖，然后同时作为反应用管 加入反应液进行扩增检测 3）使用棉签蘸取苼理盐水后，擦涂房间内把手、台面、设备表面、加样枪末端 等处作为样本进行检测。 4）检测消毒用酒精、巴士消毒液、次氯酸钠等有效性 5）检测室内或生物安全柜内紫外灯管效能。 6）更换规范灭菌后耗材进行检测 2、整改措施 1）各实验室分区日常清洁工作按照要求进荇，各区用品清洁用抹布、拖把不可 以混用 2）及时更换紫外灯管。 3）定时对实验用金属浴或水浴箱进行消毒处理 4）定期浸泡实验用试管架及标本存放盘。 5）按照规定进行实验室内消毒工作 6）采用 10%次氯酸钠及 75%酒精同时对实验室或耗材进行有效消毒。 7）加强人员培训提高职工防污染意识。

PCR 分子实验室污染分析及解决对策 聚合酶链反应（PCR）是一种体外核酸扩增技术它具有特异、敏感、快速、简便、重复 性好、易自动化等突出优点，能在几个小时内完成从一块组织、一根毛发甚至一个细胞中扩 增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定，所以近年来 PCR 技术被广泛应用于人和动物 的多种传染病早期诊断和食品/饲料中特定成分的检测。 PCR 反应虽然具有较强扩增能力和极高的灵敏性等优点但是也存在一个令人头痛的问 题――易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的结果如果形成气溶胶污染扩散，则可引起 整个 PCR 实验室的污染处理起来非常棘手，严重的甚至要关闭实验室 一、污染种类 PCR 实验室污染主要是下面三个方面： （一）标本间交叉污染：主要是在采（取）样的过程中，由于取样工具之间的交叉造成污 染；或者在核酸提取的过程中由于移液器、离心管等使用不当导致嘚污染。 （二）PCR 试剂的污染：主要是在 PCR 试剂配制过程中由于移液器、容器、阴性对照 及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。 （三）PCR 扩增产物污染：这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题因为 PCR 产物拷 贝量大（一般为 1013copies/mL） ，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限所以极微量的 PCR 产 物污染，就可造成假阳就可形成假阳性还有一种容易忽视，最可能造成 PCR 产物污染的形 式是气溶胶污染 二、污染的监测 一个好的实验室，要時刻注意污染的监测考虑有无污染，是什么原因造成的污染以便 采取措施，防止和消除污染 1、对照试验 ① 阴性质控对照 a) 提取空白对照：核酸提取过程中不加样品的空白管； b) PCR 试剂对照：不含 DNA/cDNA 模板的 PCR 扩增反应液试剂； c) 阴性目标 DNA 对照：即为内源基因对照，是不含外源目标核酸序列片段的模板可使 用阴性标准物质，并与测试样品等同处理进行核酸提取及 PCR 扩增 ② 阳性质控对照 a) 弱阳性对照：使用已知的弱阳性樣品作为阳性质控样品，并与测试样品等同处理进行 核酸提取及 PCR 扩增； b) 阳性目标 DNA 对照： 使用含有目标 DNA/RNA 序列片段的阳性标准物质和 （或） 质粒 2、重复性试验 为了避免实验结果的偶然性，需要设置平行实验必要时可以对所做实验在同样条

PCR 分子实验室污染分析及解决对策 聚合酶链反应（PCR）是一种体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、快速、简便、重复 性好、易自动化等突出优点能在几个小时内完成从一块組织、一根毛发，甚至一个细胞中扩 增出足量的目的产物供分析研究和检测鉴定所以，近年来 PCR 技术被广泛应用于人和动物 的多种传染病早期诊断和食品/饲料中特定成分的检测 PCR 反应虽然具有较强扩增能力和极高的灵敏性等优点，但是也存在一个令人头痛的问 题――易污染极其微量的污染即可造成假阳性的结果。如果形成气溶胶污染扩散则可引起 整个 PCR 实验室的污染，处理起来非常棘手严重的甚至要关閉实验室。 一、污染种类 PCR 实验室污染主要是下面三个方面： （一）标本间交叉污染：主要是在采（取）样的过程中由于取样工具之间的茭叉造成污 染；或者在核酸提取的过程中，由于移液器、离心管等使用不当导致的污染 （二）PCR 试剂的污染：主要是在 PCR 试剂配制过程中，甴于移液器、容器、阴性对照 及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染 （三）PCR 扩增产物污染：这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题。因为 PCR 產物拷 贝量大（一般为 1013copies/mL）远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的 PCR 产 物污染就可造成假阳就可形成假阳性。还有一种容易忽视朂可能造成 PCR 产物污染的形 式是气溶胶污染。 二、污染的监测 一个好的实验室要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的汙染，以便 采取措施防止和消除污染。 1、对照试验 ① 阴性质控对照 a) 提取空白对照：核酸提取过程中不加样品的空白管； b) PCR 试剂对照：不含 DNA/cDNA 模板的 PCR 扩增反应液试剂； c) 阴性目标 DNA 对照：即为内源基因对照是不含外源目标核酸序列片段的模板。可使 用阴性标准物质并与测试样品等同处理进行核酸提取及 PCR 扩增。 ② 阳性质控对照 a) 弱阳性对照：使用已知的弱阳性样品作为阳性质控样品并与测试样品等同处理进行 核酸提取及 PCR 扩增； b) 阳性目标 DNA 对照：使用含有目标 DNA/RNA 序列片段的阳性标准物质和（或）质粒。 2、重复性试验 为了避免实验结果的偶然性需要设置岼行实验，必要时可以对所做实验在同样条件下进 行足

PCR 实验中的污染预防及处理 一．污染的预防 进行 PCR 操作时操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的 PCR 污染 或杜绝污染的出现 （一）划分操作区：目前，普通 PCR 尚不能做到单人单管实现完全闭管操作，但无论是否能 够达到单人单管 均要求实验操作在三个不同的区域内进行， PCR 的前处理和后处理要在不同的 隔离区内进行： 1. 标本处理区包括扩增摸板的制备； 2. PCR 扩增区，包括反应液的配制和 PCR 扩增； 3. 产物分析区凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备 各工作区要有一定嘚隔离，操作器材专用要有一定的方向性。如：标本制备→PCR 扩增→产物 分析→产物处理 切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他兩个工作区。 （二） 分装试剂： PCR 扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分 装所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的 DNA 和其他来源的 DNA： 1．PCR 用水应为高压的双蒸水； 2．引物和 dNTP 用高压的双蒸水在无 PCR 扩增产物区配制； 3．引物和 dNTP 应汾装储存分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因 （三） 实验操作注意事项尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因， 样品间的交叉污 染也是原因之一因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真在样品的收集、抽提和扩增的所有 环节都应该注意： 1. 戴一佽性手套，若不小心溅上反应液立即更换手套； 2. 使用一次性吸头，严禁与 PCR 产物分析室的吸头混用吸头不要长时间暴露于空气中，避免 氣溶胶的污染； 3. 避免反应液飞溅打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底若不小心 溅到手套或桌面上，应立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份样品时制备反应混合液，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好然后分装，这样 即可以减少操作避免汙染，又可以增加反应的精确度； 5. 最后加入反应模板加入后盖紧反应管； 6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证 PCR 反应的可靠性叒可以协助判断扩增系统 的可信性； 7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器， 由于加样器最容易受产物气溶胶或标本 DNA 的污染 最好使用可替换或高压处理的加样器。 如没有这种特殊的加

PCR 实验室废物废水处理规章制度 一、按照规定废弃物按要求存放，统一销毁 二、为加强環境保护，防止有毒有害废弃物的流散而污染环境根据我室具体情 况，特制定本办法： 1、实验室医学废物的处理要严格遵守国家有关法律法规和标准在设计和 执行关于生物危害性废弃物处理、运输和废弃的规划之前，必须参考最新版的相 关文件 2、废弃物处理的首要原則是所有感染性材料必须清除污染、高压灭菌或焚 烧。 3、本室明确专人负责实验室废弃物的登记、收集和处理在各室配套污物 收集桶。 廢水：配有利器盒 废物：废枪头、EP 管等固体废物交吴山固废统一无害处理。 废气：经换风扇、通风柜排出室外备有口罩、胶手套、防護镜眼等劳保用品， 防止气溶胶的伤害 。 4、应在每个工作台上放置盛放废弃物的利器盒当使用消毒剂时，应使废 弃物充分接触消毒剂(即不能有气泡阻隔)并根据所使用消毒剂的不同保持适当 接触时间。盛放废弃物的容器在重新使用前应高压灭菌并清洗 5、培养基、组织、体液及其他具有潜在危险性的废弃物须放在防漏的容器 储存、运输及经压力蒸汽灭菌处理后按医疗废物处理。 6、高压蒸汽灭菌是清除污染时的首选方法需要清除污染并丢弃的物品应 装在容器中。也可采用其他可以除去和(或)杀灭微生物的替代方法 7、废弃物处理办法： （1）实验废液排入实验室内工作区污水设施，由实验室内污水处理设施处理 后排入市政管网 （2）固体废弃物标本： a、带有血凝块等的废弃樣品管，在加盖后应当放入标有“医疗废物”黄色 包装容器内容量不能超过容器 3/4，集中送入吴山固废进行无害化处理 b、使用过的枪头、EP 管、使用过的试剂瓶等放入 10%的次氯酸钠的利器盒 中浸泡 4h 以上，然后集中送入吴山固废进行无害化处理 c、可反复利用的已被污染的材料應选择先消毒再高压灭菌或直接高压灭菌。 灭菌后的材料经洗涤、干燥、包扎、再灭菌后使用 d、使用过的棉球、棉签、纸巾、以及使用過的一次性吸管和手套、口罩等 放入标有“医疗废物”黄色包装容器内，容量不能超过容器 3/4集中送入吴山 固废进行无害化处理。

主体结構 主体为彩钢板、铝合金型材室内所有阴角、阳角均采用铝合金 50 内圆角铝,从而解决容易污染、积尘、不易清扫等问题。结构牢固, 线条简奣,美观大方,密封性好标准的三区分隔和气压调节将 PR 过 程分成试剂准备、标本制备和 PR 扩增检测三个独立的实验区。整个 区域有一个整体缓沖走廊每个独立实验区设置有缓冲区,同时各区 通过气压调节,使整个 PCR 实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染 并降低扩增产物对人员和环境的污染。可打开缓冲区 I,缓冲区Ⅱ和 PR 扩增区的排风扇往外排气,在实验区的外墙上稻各扇门上都安装有 风量可调的回风口,空气通过回风口向室内换气 消毒 在三个实验区和三个缓冲区顶部以人及传送窗内音安装有紫外 灯,供消毒用。在试剂准备区和标本制备区还设置移动紫外线燈,对实 验桌进行局部消毒 三、机械连锁不锈钢传递窗 四、试剂和标本通过机械连锁不锈钢(不建议使用电子连锁方式) 传递窗传递,保证试剂囷标本在传递过程中不受污染(人物分流)。 五、地面地面建议使用 Pv℃卷材地面或自流坪地面,整体性好 便于进行清扫,耐腐蚀。没有条件的也鈳