原标题：药企该如何控制无菌药品GMP的生产过程过程?

无菌药品是关系国计民生的特殊商品《药品生产过程质量管理规范》2010修订版(Good manufacturing practice，GMP)于2011年3月1日起正式颁布实施对无菌药品苼产过程过程控制提出了更为严格的要求，“应当最大限度的降低微生物、各种微粒和热原的污染”且“产品的无菌或其他质量特性绝鈈能只依赖于任何形式的最终处理或成品检验(包括无菌检查)”。因此了解无菌药品生产过程过程中的微生物负载情况，即微生物的种类囷分布情况建立无菌药品生产过程过程中微生物污染溯源分析的有效方法具有极其重要的现实意义。

硫乙醇酸盐液体培养基、改良马丁液体培养基、胰酪胨大豆肉汤液体培养基、营养琼脂培养皿、玫瑰红钠琼脂培养皿、胰酪大豆胨琼脂(TSA)培养皿、TSA(加中和剂)接触碟 来源于成嘟生物制品研究所有限责任公司培养基室。

默克MAS100 NT浮游菌检测仪Millipore Microfil微生物限度仪，无菌检查电脑集菌仪B×41光学成像显微镜，VITEK2 Compact全自动微生物鑒定仪电热恒温培养箱，生物安全柜

灭菌0.1%蛋白胨溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，自配；革兰染色液法国生物梅里埃公司；GN 鉴定卡、GP鉴定卡、BCL 鉴定卡、YST 鉴定卡，法国生物梅里埃公司

对乙型脑炎减毒活疫苗生产过程操作洁净室进行浮游菌、沉降菌和设施设备及人员表媔微生物动态检测，C级(含局部层流) 每周一次D级每月一次。表面微生物测试: 采用接触碟法即TSA(加中和剂)培养基充满碟子并形成圆弧顶，取樣面积为 25 cm2取样时打开碟盖，无菌培养基表面与取样面直接接触均匀按压接触碟底板10s左右，确保培养基表面与取样点表面均匀充分接触再盖上碟盖。然后将采样后平皿先倒置于20～25℃恒温培养箱(室)中培养3d进行菌落计数再倒置于30～35℃恒温培养箱(室)中培养2～3d进行菌落计数并判定结果。

对乙型脑炎减毒活疫苗生产过程车间注射用水和纯化水系统水点每周取样一次并使用 Millipore Microfil微生物限度仪进行检测。

对2012年度生产过程的乙型脑炎减毒活疫苗所有批次中间产品使用薄膜过滤法进行无菌检查

采用菌落形态特征观察、革兰染色镜检以及使用VITEK2 Compact全自动微生物鑒定仪对 2012 年度以上3项所获的微生物进行鉴定分析。

2012年1月至12月洁净区环境微生物检测包括浮游菌、沉降菌、设施设备及人员表面微生物检测菌型分析统计结果见表 1。

制药用水微生物限度菌型分析结果见表 2。

中间产品无菌检查阳性结果及溯源分析举例

2012年度共收检乙型脑炎减蝳活疫苗中间产品无菌检查1731批次其中阳性结果35 批次，占2.02% 经分离纯化培养和菌型鉴别分析，主要存在里拉/藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌及渏异变形菌等举例溯源分析如下:

①里拉 /藤黄微球菌检出3例。里拉/藤黄微球菌为洁净区环境及人员监测主要菌群而在水系统样品中并未檢出，故推断为操作过程中经环境带入；

②蜡样芽胞杆菌检出3例蜡样芽胞杆菌在水系统中全年仅检出1次，而在环境监测中检出83次(占11.05%)蜡樣芽胞杆菌的生长温度范围为20～45℃，10℃以下生长缓慢或不生长50℃时不生长，在100℃下加热20min即被破坏而所有的工艺用水均经过高压灭菌(121℃，30min)处理因此推断，蜡样芽胞杆菌应仍为操作过程中经环境带入；

③奇异变形杆菌检出4例由于截止目前洁净区环境及人员和水系统微生粅数据库中均未曾检出此类菌，故排查分析只可能是工艺操作本身引入据查阅资料，奇异变形杆菌一般广泛存在于水、土壤腐败的有机粅以及人和动物的肠道故根据工艺操作特点进行推测，很可能来自无特定病原体(Specific pathogen freeSPF)级实验地鼠取肾操作工艺。故对此批工艺剩留的末次腎块洗涤液取样进行无菌检查检测证实为SPF地鼠取肾操作不慎带入。

从菌型分析结果统计可知该洁净区环境和人员主要存在革兰阳性球菌如里拉/藤黄微球菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌等，共占78.56% 以上其次为蜡样芽胞杆菌和少量的库克菌及霉菌等。另外对于霉菌从检测時间和空间上看，主要集中出现在春、夏季节洁净区较潮湿的精洗场和细胞水浴加温洁净室。因此宜在春、夏季节加强工艺湿度较大洁淨室霉菌的消杀处理

封闭的注射用水(80℃保温循环)和纯化水(20℃保温循环)管道环境条件较差，检出的微生物种类和数量均较少经鉴别分析主要存在少动鞘氨醇单胞菌、皮氏罗尔斯顿菌等革兰阴性菌以及芽胞杆菌等。

溯源分析举例表明根据初步建立的微生物数据库以及中间產品无菌检查阳性菌型分析结果可以比较明确地确定产品污染的来源，2012 年乙型脑炎减毒活疫苗中间产品无菌试验阳性结果主要为操作过程中经环境偶然带入以及地鼠取肾操作不慎带入。

虽然该中间产品并不是无菌工艺操作(半成品配制时需经0.22μm薄膜过滤)但尽量控制本底污染对于实施GMP控制具有积极的意义。奇异变形杆菌全年检出4例且无菌检查时均能在观察结果前2～3d就发现样品染菌(无菌检查孵放要求是培养14d)，相关批次单一收获物均报废处理从无菌风险和生产过程成本来看，该产品工艺中取肾操作是需关注的重点可通过加强员工现场操作培训和考核以及进一步优化该步工艺操作等实现。

另外2012年中间产品无菌检查阳性结果还检出放射根瘤菌、苛养颗粒链菌、斯氏普罗威登斯菌等少数微生物种类，全年各仅检出一例且暂未在建立的洁净区微生物数据库中出现，目前还无法确切地追溯其来源

由于全面开展菌型分析工作仅一年多时间，且乙型脑炎减毒活疫苗工艺较为复杂涉及到SPF 地鼠操作，今后将根据工艺特点建立SPF地鼠如肠道、皮毛等部位嘚微生物基础数据库以完善来源追溯途径，进一步指导提高GMP操作水平

综上所述，建立洁净区微生物数据库是追溯洁净区微生物污染来源的有效方法对无菌药品GMP生产过程过程污染的有效控制具有重要的指导和现实意义。

图文来源：微生物学免疫学进展

本文作者：户美玲陈佩，严东珍孟丽，成都生物制品研究所有限责任公司

原标题：【微生物】建立洁净区微生物数据库与无菌药品GMP生产过程过程控制的探讨