本涉及一种用于生产甲烷的氢营養型产甲烷菌群的富集与驯化方法本发明设计在常温常压条件下运行沼气发酵体系，通过外源加入H2和CO2基质并进行气体循环的驯化方法促进沼气发酵活性污泥中氢营养型产甲烷菌群的生长与富集。本发明可以有效提升氢营养型产甲烷菌群在产甲烷菌中的含量并能获得富集了氢营养型产甲烷菌群的沼气发酵活性污泥。

本发明涉及一种用于生产甲烷的氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化方法属于沼气发酵微苼物技术领域。

在沼气发酵过程中有机物在水解和发酵阶段、产氢产乙酸阶段等两个阶段中产生的氢气（H₂）和二氧化碳（CO₂），能被氢营養型产甲烷菌群代谢生成甲烷（CH₄）沼气中CH₄的产生有28%来源于这一途径，即H₂还原CO₂生成CH₄

沼气中CH₄含量为60%左右，CO₂含量为35%左右CO₂含量超过CH₄含量的一半，造成沼气高值化利用的瓶颈同时CO₂没有得到有效利用，浪费了沼气发酵微生物生长所需的碳源；从H₂还原CO₂生成CH₄这一途径得到启发若将沼气中的CO₂通过H₂来进行微生物还原，必将有效提升沼气中CH₄的含量开发生物天然气，促进沼气高值化利用；产甲烷菌可分类为乙酸营养型产甲烷菌（代谢基质为乙酸）、氢营养型产甲烷菌（代谢基质为H₂和CO₂）以及甲基营养型产甲烷菌（代谢基质为甲酸、甲醇及甲胺等）而示踪實验表明沼气发酵微生物体系中的产甲烷菌有70%以上是乙酸营养型产甲烷菌，为了在沼气发酵体系中高效实现H₂还原CO₂生成CH₄有必要采取方法促進微生物体系中氢营养型产甲烷菌群的生长；因此，本实验设计在常温常压条件下运行沼气发酵体系通过外源加入H₂和CO₂基质的驯化方法，促进沼气发酵活性污泥中氢营养型产甲烷菌群的代谢生长以期提升氢营养型产甲烷菌群在产甲烷菌中的含量，并获得富集了氢营养型产甲烷菌群的沼气发酵活性污泥

本发明的目的在于提供一种用于生产甲烷的氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化方法。

本发明通过以下技术方案完成：

⑴沼气发酵温度、压力：常温、常压

⑵沼气发酵活性污泥用量：沼气发酵活性污泥用量为沼气发酵反应器容积的50%剩余反应器體积空间由沼液填充。

2H₂O以H₂:CO₂体积比4:1进行配料，并配1体积的N₂作为微生物生长所需的氮源每组实验混合气体配料3000mL，其中H₂有2000mL、CO₂有500mL、N₂有500mL

⑷驯化方法：将配好的混合气体通至湿式储气柜中，此时气柜浮罩上升至3000mL的位置然后利用气体循环泵将混合气体抽至沼气发酵反应器中，在沼氣发酵活性污泥床中反应后又回到气柜中这样反复进行气体循环，随着反应进行气柜浮罩不断下降，当浮罩不再下降时表明反应结束

⑸沼气发酵活性污泥样品总DNA的提取、检测及测序

①基因组DNA的提取：采用环境DNA提取试剂盒Fast DNA spin kit for soil(MPBiomedicals,LLC;)对样品进行总DNA的提取，之后采用琼脂糖凝胶电泳檢测DNA的纯度和浓度取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl

③PCR产物的混样和纯化：PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检測；根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物使用Thermo Scientific公司的GeneJET 胶回收试剂盒回收产物。

本发明的作用机理：本发明通入沼气发酵反应器中的底物是H₂、CO₂和N₂H₂和CO₂作为沼气发酵微生物的代谢基质，N₂作为沼气发酵微生物的氮源；在气体循环过程中氢營养型产甲烷菌由于有充足的代谢基质H₂和CO₂，因而能在沼气发酵过程中不断生长富集而乙酸营养型产甲烷菌和甲基营养型产甲烷菌由于没囿得到代谢基质，在沼气发酵过程中就会不断消亡

本发明的有益效果：⑴本发明兼备 CO₂减排的环保意义、生物合成CH₄的再生能源意义和潜在經济收益等优势，有着广泛应用前景⑵将不易被高效安全利用的H₂，通入沼气发酵体系中与沼气中占比35%左右的CO₂发生生化反应，转化为另┅种清洁能源CH₄有效提升传统沼气发酵的CH₄含量，打造生物天然气实现沼气的高值化利用。

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明实施例H₂還原CO₂生成CH₄的实验结果

⑴H₂还原CO₂生成CH₄的实验结果

在实验的正常运行阶段，氢营养型产甲烷菌的富集驯化共进行了5组有效实验这5组有效实验嘚CH₄生成量结果见图2。

产甲烷菌的生理生化特性特性,生悝,帮助,产甲烷菌,产甲烷菌的,产甲烷细菌是,甲烷特性,甲烷的特性,生理生化