一、实验材料 菌种：某浸矿混合菌 设备：eppendorf管、移液枪、台式高速离心机、电泳仪、水浴锅、PCR仪、无菌操作台、牙签、枪头、酒精灯。 试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒、LB液體培养基、LB固体平板培养基、TE缓冲液（pH 8.0）、切胶回收试剂盒、Taq DNA polymerase10 mM 菌液中约含1.0×109细胞，用灭过菌的1.5mL离心管去菌液1 ml室温10,000 rpm离心1 min，收集菌体 1.2 基洇组DNA的提取 （使用前先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积参照瓶上的使用说明） 1.向菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮； 2.向管中加入20 μl 蛋白酶K溶液混匀； 3.加入220 μl 缓冲液GB，振荡15秒70℃放置10 min，溶液应变清亮简短离心以去除管盖内壁的水珠；若溶液未變清亮，说明细胞裂解不彻底可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯； 4.加入无水乙醇，充分振荡混匀15秒此时可能会出现絮状沉淀，简短离惢以去除管盖内壁的水珠； 5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心30秒，倒掉废液将吸附柱CB3放叺收集管中； 6.向吸附柱CB3中加入500 μl 缓冲液GD，12,000 rpm离心30秒倒掉废液，将吸附柱CB3 放入收集管中； 7.向吸附柱CB3中加入700 μl 漂洗液PW12,000 rpm 离心30秒，倒掉废液吸附柱CB3放入收集管中； 8.向吸附柱CB3中加入500 μl 漂洗液PW，12,000 rpm离心30秒倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中； 9.将吸附柱CB3放回收集管中12,000 rpm离心2分钟，倒掉废液将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； 10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl 洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟12,000 rpm 离心2分钟，将溶液收集到离心管中为了增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中室温放置2分钟，12,000 rpm离心2分钟洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液應保证pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围）pH值低于7.0会降低洗脱效率，且DNA产物应保存在-20℃以防DNA降解。 1.3 DNA检测 配置0.8%的琼脂糖凝胶点樣5μl ,约80V 电泳20-30分钟，置于凝胶成像系统或紫外投射检测仪上观察条带具体步骤如下： 1制胶（80ml）：称取0.64g琼脂糖，加入80ml 的1×TAE缓冲液（pH8.0）摇匀；微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；将胶板放入制胶槽中插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入5.0 μl EB 後混均匀，倒入其中直至厚度为4-6mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固（约30-45min）将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子以保证点样孔完好。 2 点样：用微量移液器将5μl含蓝色染液的Marker加入点样孔下部样品与Loading Buffer混匀后进行点样。 3 电泳：打开电源开关调节電压至3-5V/cm(约80V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动约20-30min后即可观察结果。 4 观察：将电泳好的胶置于紫外投射检测仪上打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度 2 16s rDNA PCR扩增 1 在冰盒上操作，按从大体积到小体积的次序将各成分加入一无菌PCR管中 試剂 体积/μl 10×PCR