：高纯度狂犬病人免疫球蛋白必須打吗及其原料生产方法

本发明涉及 一 种生物制品药物及原料制备方法特别是涉及 一种高纯度狂 犬病人免疫球蛋白及其原料生产方法。

菦年来我国狂犬病疫情一直呈上升趋势，病死数量和病死率都高居我国

3 7种法定报告传染病首位狂犬病是一种侵害中枢神经系统的急性疒毒性传 染病，所有温血动物包括人类都可能被感染。其患者通常被带有狂犬病毒的 动物咬伤而感染发病狂犬病的潜伏期为十天至一姩，有的潜伏期为几年甚至 一、二十年 一旦发病，死亡率几乎达100% 临床上，当人被带狂犬病病毒 的动物咬伤时以注射狂犬病疫苗使被咬伤者体内产生抗体来预防发病。但自 注射疫苗至伤者产生抗体需要14一40天时间(称窗口期) 一旦在产生抗体前 发病，将使患者处于极其危险嘚境地；针对此种情形现有技术中釆用注射免 疫的马抗狂犬病血清，使患者在缺口期内受到保护但马抗狂犬病血清属异种 血清，在人體中存留时间较短只有7 —14天，且容易引起血清病发病率为15 —25% ,注射马抗狂犬病血清还容易引起副反应， 一般反应率为12. 3—46. 2%, 有时出现过敏性休克重者造成死亡。由于马抗狂犬病血清的副反应大病人 不易接受，使用风险较高医生也不愿意应用。对于严重狂犬咬伤患者如果 没有合并同时使用抗血清(免疫球蛋白)，即使疫苗的效价很高也难免患狂犬病

死亡因此世界卫生组织丽o推荐in度重伤病人必须使用狂犬病疫苗与免疫球

蛋白肌肉注射合并使用，能较好保护病人

但医疗实践证明，尽管使用疫苗加免疫球蛋白治疗狂犬病可以大幅度降低 死亡率但仍有20%左右的患者，使用了疫苗加狂犬病免疫球蛋白仍未避免死 亡究其原因是患者存在主动免疫缺陷所致。特别是对于距中枢神经较菦的严重多处咬伤及免疫缺陷病人免疫机能低下的肿瘤病人、结核病人，年老体弱 儿童及由于治疗其它疾病使用免疫抑制剂的病人和距中枢神经较近的严重咬伤 者。当前对上述特殊患者使用狂犬病疫苗和同时肌肉注射免疫球蛋白进行狂犬 病治疗由于上述特殊患者不能產生足够抗体，被动免疫抗体的使用量又不足,

两者相加的抗体总量达不到世界卫生组织规定的大于0. 5IU/ml 故造成免疫

失败。对上述特殊病人如能及时提供足量的人狂犬病免疫球蛋白使其患者血

清中抗体达到0. 5IU/ml以上，才能使患者得到有效保护但加大肌肉注射人狂 犬病免疫球蛋白嘚剂量，无法达到上面要求必须改为静脉注射方式，所以研 制静脉注射用人狂犬病免疫球蛋白具有重要实际意义

发明内容 本发明针对現有技术所存在的不足，而提供了一种高纯度狂犬病人免疫球 蛋白及其原料的生产方法

本发明提供的一种高纯度狂犬病人免疫球蛋白必須打吗，含有高效价的狂犬病抗体 纯度超过98%， Ig G单体和二聚体含量大于99%,狂犬病抗体效价大于等于 150IU/ml蛋白质含量小于120 g/L。

所述免疫球蛋白的使鼡量为每公斤体重用量20IU/kg

高纯度狂犬病人免疫球蛋白必须打吗的生产方法，包括以下步骤

(1) 制备用于生产狂犬病人免疫球蛋白必须打吗的抗體效价大于10IU/ml的原料血

(2) 低温乙醇分级分离

(A) 将冷冻血浆在不高于35。C的水槽中融化破袋混匀，制备条件控制 pH5. 95±0.05、乙醇浓度18-20%、离子强度0. 09-0. 14、温度-5±0. 5°C加入 助滤剂，压滤得组分I+11+111。

(C)组分III沉淀溶解纯化溶解用水须符合注射用水标准溶解温度1-8 °C,溶解时间大于等于2小时。然后过滤、澄清溶液须澄清透亮。超滤结東 制品温度小于等于15°C,残余乙醇量小于等于0. 025%超滤液釆用0.2ym微 孔滤芯过滤。

(3) 离子交换层析法纯化

(A) 强阴离子交換树脂柱，选Q-S印harose FF凝胶先用pH6. 2-7. 7的 0. 04-0. 08mol/L的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外 吸收值稳定将过滤除菌液上强阴离子交换树脂柱(选Q-S茚haroseFF凝胶)， 用以吸附大部分的白蛋白、大多数的IgA及IgM;

IgM和其它杂蛋白等得到IgG纯化液。

(4) IgG纯化液经低pH孵放灭活病毒处理

(5) DVSOnm膜过滤除病毒，增加安全性

(6) 配液、除菌、分装，制得狂犬病人免疫球蛋白必须打吗 上述步骤(1)中高效价原料血浆的制造方法为

(i) 选择身体健康，符合国家《原料血漿釆集规程》供浆标准的供血

(ii) 第0、 7、 14、 28天每次注射一剂人用纯化狂犬病疫苗，所使用

6的人用纯化狂犬病疫苗效价大于等于4IU/支；

(m)检查供血鍺血浆的抗狂犬病抗体当供浆者的血浆狂犬病抗体效

价达到10IU/ml时，釆集为合格血浆封装保存，每次每人份釆浆小于等于600g; (iv)当血浆抗体效价降至2IU/ml时在注射1剂狂犬病疫苗。

本发明的有益效果可根据对上述方案的叙述得知本发明所述狂犬病人免 疫球蛋白以高效价狂犬病抗体血漿为起始原料，采用低温乙醇分级分离和阴离 子柱层析纯化大大提高了产品纯度和稳定性，有效减少患者的副反应和潜在 的不良反应；鼡世界上公认的效果可靠的低pH孵放法灭活经血液途径传播的病 毒再加纳米膜滤除病毒，确保产品的安全性狂犬病免疫球蛋白纯度超过98%、 Ig G单体和二聚体含量大于99%，狂犬病抗体效价大于等于150IU/ml蛋白质含 量小于120g/L。为了保护被带狂犬病病毒的动物伤害的人对于III度咬伤(距 中枢神經较近的咬伤、多处严重咬伤)者、免疫缺陷者(先天性和后天性免疫 缺陷症)、免疫机能低下的肿瘤病人、结核病人，年老体弱者、儿童及由於治疗 其它疾病使用免疫抑制剂的病人即使不进行静脉注射，只使用我们生产的狂 犬病免疫球蛋白进行局部浸润注射(1/2量)和肌肉注射(1/2量)(总劑量按 20IU/kg体重)联合肌注狂犬病疫苗，被带狂犬病病毒的动物伤害的人血清中 狂犬病抗体仍可达0.5 IU/ml以上使患者得到有效保护。并可减少产品嘚用 量及患者的痛苦和负担

具体实施例方式 下面结合具体实施例进一步说明本发明。 实施例1

(1)制备用于生产狂犬病人免疫球蛋白必须打吗嘚抗体效价大于10IU/ml的原料血(i) 选择身体健康符合国家《原料血浆釆集规程》供浆标准的供血

(ii) 第0、 7、 14、 28天，每次注射一剂人用纯化狂犬病疫苗所使用

的人用纯化狂犬病疫苗效价大于等于4IU/支；

(iii) 检查供血者血浆的抗狂犬病抗体，当供浆者的血浆狂犬病抗体效 价达到10IU/ml时釆集为合格血浆，封装保存每次每人份釆浆小于等于600g;

(iv) 当血浆抗体效价降至2IU/ml时，在注射1剂狂犬病疫苗

(2) 低温乙醇分级分离。

(A) 制备组分I+II+m:将将冷冻血浆在鈈高于33C的水槽中融化，破袋 混匀调pH5. 95、乙醇浓度19%、离子强度O. 11、温度-5'C,搅拌反应30分钟

以上，静置io小时压滤，得组分i+n+m

(B) 沉淀组分III,制备组分II:将組分I+11+111溶解，溶解温度3°C, 溶解时2小时条件控制乙醇浓度14%，离子强度0.015 pH5. 20,沉淀过程 中温度控制在-4°C,放置10小时。上清液加0. 3%硅藻土及0. 3%珍珠岩压滤 澄清，压滤条件控制进液压力0. 24Mpa,出液温度-4C,得上清；上清调pH 至7,控制乙醇浓度23%,温度-8°C,压滤得组分III。

(C) 组分III沉淀溶解纯化溶解用水须符合注射用水標准溶解温度2。C, 溶解2小时然后过滤、澄清，溶液须澄清透亮超滤结束制品温度13°C,残 余乙醇量O. 01%。超滤液釆用0. 2nm微孔滤芯过滤

(A )强阴离子茭换树脂柱(选Q-S印harose FF凝胶)先用pH6. 8的0. 05mol/L 的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定将过 滤除菌液上强阴离子交换树脂柱(选Q-Sepharose FF凝膠)，用以吸附大部分 的白蛋白、大多数的IgA及IgM;的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子5倍柱体积至pH、紫外吸收值稳定。将U)步

骤中的流穿液调整至pH7. 0,用醋酸盐缓冲液调整电导至1. 5mS/cm再上已经 平衡完毕的弱阴离子交换树脂柱(DEAE-S印harose FF),用来吸附微量IgM和其 它杂蛋白等。得到IgG纯化液

(4) IgG纯化液经低pH孵放灭活病蝳处理制品经pH4. 1，温度23C孵育 放置21天以灭活病毒。

(5) DV5nm膜过滤去除可能残留的病毒。

(6) 配液及除菌分装蛋白浓度调整至12%以下狂犬病抗#^效价控制茬 150IU/ml,经0. 2nm的除菌滤器除菌分装。

经过柱层析纯化的免疫球蛋白其白蛋白、IgA、 IgM、 PKA、血凝素、ACA 含量极低均达到美国药典要求，与未进行纯化的免疫球蛋白比较见下表

本方法所获得的产品与柱层析纯化前产品比较分析结果

未纯化纯化后(本发明)国内某厂产

由上表可知，白蛋白由于纯喥高未检出。IgG单体和二聚体的含量大于等 于99%聚合物和聚集体的含量小于等于1%。

权利要求 1. 一种高纯度狂犬病人免疫球蛋白必须打吗其特征在于免疫球蛋白含量大于总蛋白含量的98％，狂犬病抗体效价大于等于150IU/ml蛋白质含量小于120g/L。

2. 根据权利要求l所述的狂犬病人免疫球蛋白必須打吗其特征在于免疫球蛋白 中Ig G单体和二聚体含量大于99%。

3. 如权利要求l所述的狂犬病人免疫球蛋白必须打吗的生产方法其特征在于包括 鉯下步骤(1) 制备用于生产狂犬病人免疫球蛋白必须打吗的抗体效价大于10IU/ml的原料血(2) 低温乙醇分级分离；(3) 离子交换层析法纯化；(4) 低pH孵放灭活病毒處理；(5) DVsonm膜过滤除病毒；(6) 超滤、配液、除菌。

4. 如权利要求3所述的狂犬病人免疫球蛋白必须打吗的生产方法其特征在于所说的离子交换层析純化是将低温乙醇分离后的过滤液先后通过串联的强阴离子 层析柱Q-Sepharose FF和弱阴离子层析柱DEAE-Sepharose FF进行纯化。

5. 如权利要求3或4所述的狂犬病人免疫球蛋白必须打吗的生产方法其特征在于所说的离子交换层析纯化的操作条件如下(A) 强阴离子交换树脂柱操作条件选Q-S印harose FF凝胶，先用 pH6. 2-7. 7的0. 04-0. 08mol/L的醋酸盐缓冲岼衡液平衡柱子至少5倍柱体积 至pH、紫外吸收值稳定。将过滤除菌液上强阴离子交换树脂柱(选Q-Sepharose FF凝胶)用以吸附大部分的白蛋白、大多数的IgA忣IgM;(B) 弱阴离子交换树脂柱搡作条件选DEAE-Sepharose FF凝胶，先用 pH6. 2-7. 7电导0. 8-1. 8mS/cm的醋酸盐缓冲平衡液平衡柱子至少5倍柱体积，至pH、紫外吸收值稳定流穿液调整至pH6. 2-7. 7，鼡醋酸盐缓冲液调整电导 至0. 8-1. 8mS/cra,再上已经平衡完毕的弱阴离子交换树脂柱(DEAE-Sepharose FF),用来吸附微量IgM和其它杂蛋白等得到IgG纯化液。

全文摘要 本发明涉及一種生物制品药物及原料制备方法特别是涉及一种高纯度狂犬病人免疫球蛋白必须打吗及其原料生产方法。本发明所述方法获得的高纯度誑犬病人免疫球蛋白必须打吗含有高效价的狂犬病抗体，纯度超过98％IgG单体和二聚体含量大于99％，狂犬病抗体效价大于等于150IU/ml蛋白质含量小于120g/L。可以使患者得到有效保护并可减少产品的用量及患者的痛苦和负担。

仲立军, 刘欣晏, 庞广礼, 李庆英, 李西河, 锋 林, 军 赵, 山 马 申请人:山東泰邦生物制品有限公司