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关于RT-PCR中逆转录试剂盒的问题！
各位做过逆转录的高手们，本人在日购买到RT试剂盒，到现在快有5个月了，8月份才开始使用。在8月份的时候做RT-PCR目的基因可以扩增出来，等到9月中旬的时候，一直扩增不出目的条带，检测RNAOD比值2.01，电泳效果完整性也比较好，5s不太亮。我想问一下各位，有没有可能是试剂盒中的逆转录酶的活力下降了，反复冻融后活力下降了？我买了后没有分装逆转录酶，只是用的时候从-20度取出来，放在冰盒上操作，再放回-20度。前后如此操作差不多有20次。原因是不是8月份的时候是夏天，气温挺高的（四大火炉之一），酶拿出来后温差太大，这样子，反复冻融操作出现活力下降了！？？ 请分析一下原因，谢谢了！
公司间的试剂盒不能混搭。而且逆转录的protocol各个公司的也不完全一样。
p不出来指反转后的cDNA为模板，P不出目的基因。当加入的酶的量是1ul的时候，内参都没有，当加入3ul的时候，才可以看见内参。我做的人晶状体上皮细胞。我所提取的RNA是立即进行了RT-PCR，没有反复冻融！ 一般mRNA的半寿期我们好像没有关注这个问题啊！&&
我所用的试剂盒中有两种逆转录的方法，有一种需要进行65度5min的RNA变性，主要是破除mRNA的复杂的结构，但是我没有采用这种方法，我担心会有RNA的降解，就采取了另一种，不用65度5min的变性处理。不知道这个会不会产生什么影响！
对于复杂的mRNA来说，例如你做的RNA是人的，最好要变性。否则逆转录的温度较低，复杂结构影响引物与模板结合，cDNA的合成效率降低。一般相对简单的RNA，如原核生物的可以不做变性这一步。
恩 有道理啊&&不过我见到一位同事从人的Hepg2细胞中提取rna做RT-PCR的时候也没有使用这一步，照样可以将1500bp的目的片度扩增出来，试剂盒都是一样的，可能还有其他的原因吧。您说的也很有道理，谢谢了！
谢谢！cDNA跑电泳怎么样检测其完整性？没听说过cDNA还要跑电泳的啊？电泳显示什么效果才说明cDNA是好的呢？？？
还有我想问一下，您的逆转录的试剂盒是哪家公司的？？谢谢！
反转好的cDNA用内参去P,如果出现内参条带，证明你反转结果很好。
恩 ，您说的是有道理的，可是现在连内参都没有哎，我觉得我RNA应该是没有问题，都提取了那么多了，一开始也总是认为RNA不好，但是测完OD比值和跑完电泳后，我觉得不是RNA问题了，可能问题就出在了反转录上。
我原来通常用18S和B-ACTIN，你可以合成，做分子必备的。祝成功
昨天P了一下，发现出来了内参基因，将TaqPlus酶的量加倍了。&&但是电泳后感觉在内参下面还有模糊的条带，那个我觉得不是由于非特异性扩增引起的，还值得讨论一下，总之，非常感谢您！！
取3-5微升cDNA跑电泳，看一下条带的弥散情况，应该是从低分子量到高分子量分布均匀。我自己曾经有过类似你的经历，需要重新克隆基因。从-80冰箱取的RNA，跑电泳，看不出降解，但是P不出来，后来检测了cDNA,cDNA不完整。后来重提RNA的。
我用的酶是promega的，一向是对折销售的那款，要另外订RNA酶抑制剂。
恩 非常感谢！！！ 您的意思还是RNA出现了问题，我还是两个方面走走看，一是重新提取RNA；另外换一下逆转录酶试一试，谢谢！
我觉得内参出来， 目的基因不一定会有的
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构建全长cDNA文库哪个试剂盒比较好
wlNC04PC32
———高质量、全长、高基因代表度的cDNA文库构建试剂盒 ● 通过SMARTTM cDNA合成技术获得全长cDNA● 无需接头连接直接进行cDNA克隆● 可方便快速的将文库插入片段转移到多种Cretor表达载体中,进行功能学研究● 起始材料可以是ng级的Total RNA或者PolyA+ RNA技术原理：采用的是SMART cDNA合成技术,详细的技术原理与技术优势请参阅“SMART cDNA合成技术简介”.图1.中列出了“SMART文库构建试剂”与“常规文库构建”的比较.技术路线：Clontech推出的两个文库构建试剂盒操作流程都非常的简便、流畅.首先通过SMART技术得到全长的双链cDNA,再通过限制酶Sfi酶切后,可直接连接到文库载体中.操作流程如图2所示.两款试剂盒可供选择Clontech推出了两款cDNA文库构建试剂盒,分别为：SMART cDNA Library Construction Kit（编号：634901）；Creator SMART cDNA Library Construction Kit（编号：634903）.两种文库构建试剂盒采用的技术原理是一样的,区别仅在于选用的文库载体不同：634901选用的是噬菌体载体λTripIEx2；634903采用的是质粒载体pDNR-LIB.两个方案可以采用一个是对于只有少量RNA的研究人员设计的；另一个是对于有大量RNA材料来设计的.第一个方法中仅需要50 ng的总RNA,需要一步长距离PCR步骤.第二个方案中,当实验材料是1μg或者更多的Poly A+ RNA时,用引物延伸的方法代替长距离PCR.后续操作方便通过这两款试剂盒构建的cDNA文库得到的插入片段可以方便的通过Cre-LoxP重组介导转化到多种表达载体中,从而方便的进行功能学分析.请参阅“Creator克隆和表达系统简介”.cDNA 文库构建的基本原理与方法cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合.经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物,或者用随机引物,给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头,连接到适当的载体中获得文库.其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定),要构建一个高质量的 cDNA 文库,获得高质量的 mRNA 是至关重要的,所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心.由于 RNA 酶存在所有的生物中,并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境,因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要.在获得高质量的 mRNA 后,用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链,cDNA 第2链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I,同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应),合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断,扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定.这里强调的是对载体的选择,常规用的是 λ 噬菌体,这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端,可用来构建柯斯质粒,这种质粒能容纳大片段的外源 DNA.
除了这个试剂盒之外，还需要买别的什么试剂么？所用的限制性内切酶都是一样的么？是否需要单独购买，谢谢
别的试剂我不知道了、
单独购买！
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请问你们做分子的，通常那些试剂在哪家公司买比较好呢？比如酶，载体
Vazyme的老板是南京农业大学的副教授，一心不搞科研只想赚钱~~~我几个同学在他们公司，据说产品不错~~
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请教RNA反转录成cDNA，用于克隆和表达，选用哪个试剂盒比较好啊？
请问，用植物组织的RNA反转录成cDNA，然后特异性引物进行扩增目的片段，电泳、切胶、回收等…………，反转录这一步我买的是Takara的PrimeScript(TM) II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，这一款试剂盒。但是据说反转录的cDNA有基因组DNA，会不会影响后续的实验，大家都是用的哪个反转录试剂盒呢？
请问您也是做的克隆么？麻烦您确认一下您用的是不是这个试剂盒？
嗯嗯，对的。50次的确实是一千二三，但是不知道这个做反转录，不除基因组DNA会不会有影响。
去除基因组DNA的不是这一款，是另外一款。这个说是只能用于荧光定量的反转录
哦哦，好的，我还需要再查阅资料，问问其他师兄师姐
您好，麻烦能说的详细一点么？现在不知道选用哪个好了。
好的，谢谢！
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反转录试剂盒和RT-PCR反转录试剂盒有什么区别试剂盒有什么区别吗？
一个可能做反转录PCR的,另一个可能做实时定量荧光PCR的.反转录PCR由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”,由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成.随后,DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成,随每个循环倍增,即通常的PCR.原先的RNA模板被RNA酶 H降解,留下互补DNART-PCR可能是实时PCR(real-time PCR),属于荧光定量PCR（Q-PCR）的一种.以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析.
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名称没有区别，可能不同产品标记了不同的名字。产品内含物可能有一定区别，如配方等。但目的都一样，进行RNA反转录。------中国西部生命科学论坛
反转录试剂盒只做反转录的过程，做完之后得到cDNA了再自己找试剂做PCRRT-PCR试剂盒可以一步到位，将RNA模板加进去之后做完反转录可以直接再做PCR
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