CRM1调控Mps1亚细胞定位的机制研究--《安徽大学》2013年硕士论文
CRM1调控Mps1亚细胞定位的机制研究
【摘要】：真核生物中,细胞通过有丝分裂将姐妹染色单体平均分配到子细胞中,使每个子细胞得到与母细胞完全相同的染色体,这对于维持生物体基因组的稳定性具有重要的意义。为确保有丝分裂过程能够准确无误的完成,细胞利用一系列的调控元件来对有丝分裂的关键步骤(包括有丝分裂进入,后期启动,有丝分裂退出)进行监控。纺锤体组装检查点(Spindle assembly checkpoint, SAC)是一个非常保守的有丝分裂调控机制,主要检查纺锤体微管与染色体动粒之间是否正确连接,通过激活一系列蛋白的相互作用将细胞阻止在有丝分裂中期,直到所有的染色体都排列到有丝分裂赤道板上,并为纺锤体微管正确的捕获,此时,检查点信号消失,细胞从中期进入后期。该检查点的缺失会导致肿瘤的发生。
Mps1是一个可以磷酸化丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的双特异性蛋白激酶,且具有自身磷酸化活性,是SAC的重要组成成分,通常位于SAC信号途径的上游,对于检查点的激活和维持是必需的。Mps1的亚细胞定位受到严格的细胞周期调控：在间期,Mps1主要分布在细胞质,中心体和核孔上；当细胞进入有丝分裂期时,Mps1从细胞质进入到细胞核且在前期,前中期出现明显的动粒定位,到中期后期Mps1在动粒上的定位逐渐减少；当细胞有丝分裂结束核膜重新形成后,Mps1又被重新运出细胞核。
细胞核内的货物蛋白要完成出核的过程通常需要另外一些蛋白的辅助,这些辅助蛋白包括：CRM1, RanGTP, Ran-GAP1等。CRM1是核转运受体importinβ家族的一员,它可以识别亮氨酸富集的核输出信号序列,将蛋白质从细胞核运出到细胞质,另外,它也可以帮助许多RNA完成核质转运。Leptomycin B (LMB)是CRM1的特异性抑制剂,它可以直接和CRM1结合,从而抑制CRM1介导的蛋白出核。根据实验室前期的研究以及Mps1相关文献的报导,我们分析,Mps1作为细胞周期中的主要蛋白,很可能也受CRM1的调控,然而,关于CRM1调控Mps1进而影响有丝分裂过程的机制,目前知之甚少。
为验证Mps1是否受CRM1的调控,本文首先通过GST-pull down实验,证实Mps1与CRM1存在相互作用。因CRM1通常是与蛋白的核输出信号序列(nuclear export signal,NES);结合,所以我们推测Mps1很可能存在出核序列。我们通过NetNES和ELM软件分析Mpsl的蛋白序列,发现了一个典型的核输出信号序列pNES1,该序列具有通常的核输出信号序列所具有的亮氨酸聚集区。将该序列与EGFP融合,能够将EGFP靶向定位至细胞质,加入LMB则能重新诱导EGFP的入核。为了进一步分析pNES1对于Mps1定位的影响,我们将Mps1中pNES1序列中的几个氨基酸突变,出乎意料的是该突变并没有引起Mpsl的细胞核积累,LMB处理也不能诱导该突变的Mps1在间期入核,因此,我们推测可能pNES1对Mps1在间期的出入核均是需要的。我们进一步以稳定表达YFPMpsl融合蛋白的结肠癌细胞系SW480YFPMps1为模型,通过免疫荧光和活细胞摄影实验观察了LMB处理对YFPMpsl的亚细胞定位的动态影响。研究发现,LMB处理能够引起Mps1在细胞核内的大量积累,且随着LMB处理时间的延长,Mpsl在细胞核内的积累越多；进一步观察Mpsl在动粒上的定位,发现LMB处理能够显著增加Mps1在有丝分裂中期和后期动粒上的定位；对HeLaS3H2BGFP细胞系的活细胞摄影实验发现,LMB处理使细胞有丝分裂进程延长了约20min。通过上述研究,我们初步揭示了间期CRM1对Mps1分子在中期动粒上的解离是需要的,破坏两者之间的相互作用会影响细胞有丝分裂进程,为深入了解Mpsl的功能提供了新的视角。
【关键词】：
【学位授予单位】：安徽大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q26【目录】：
摘要3-5Abstract5-7目录7-9缩略词表9-11引言11-21 1 纺锤体组装检查点(spindle assembly checkpoint,SAC)11-14 2 单极纺锤体蛋白激酶1(monopolar spindle,Mps1)14-18
2.1 Mps1的分布及其动粒定位15-16
2.2 Mps1的功能16-18
2.2.1 纺锤体检查点调控16
2.2.2 Mps1调控染色体在中期板上的排列16-17
2.2.3 中心体复制17
2.2.4 在胞质分离中的作用17
2.2.5 在DNA损伤检查点中的功能17-18 3 Mpsl在肿瘤治疗中的应用18-19 4 核输出信号受体(chromosome region maintenance 1,Crm1)19-20 5 研究目的意义20-21材料方法21-33 1 材料21-25
1.1 细胞株、菌株及质粒21-22
1.2 抗体22
1.3 培养基、试剂、试剂盒22-23
1.3.1 培养基22
1.3.2 试剂及试剂盒22-23
1.4 细胞核染料及同步化药物23
1.5 引物23-24
1.6 仪器24-25 2 方法25-33
2.1 细胞的培养、冻存和复苏25
2.2 引物的处理25
2.3 pRex-EGFP-pNES-IRES-hygro重组质粒的构建25-26
2.4 pRex-EGFP-Mps1△pNES1-IRES-hygro质粒的构建26
2.5 pRex-EGFP-MpslsiRMutpNES1△pNES2质粒的构建26-27
2.6 搭桥法构建 pRex-EGFP-MpslsiRMiitp]VESlApNES2ApNES3质粒27-28
2.7 质粒DNA的提取28-29
2.8 琼脂糖凝胶回收29
2.9 蛋白质的Westrn blotting实验29-30
2.10 真核细胞转染30
2.11 细胞同步化处理30-31
2.12 免疫荧光实验31
2.13 GST-pull down31-32
2.14 活细胞摄影实验32-33结果33-47 1. CRM1与Mps1存在相互作用33-34 2. 用软件预测Mps1的可能NES序列34-36 3. pRex-EGFP-pNES-IRES-hygro重组质粒的构建36-37 4. 三个NES序列对EGFP亚细胞定位的影响37-39 5. Mps1突变质粒的构建39-40 6. Mps1突变体的亚细胞定位40-41 7. pNES1突变对Mps1亚细胞定位的影响41-43 8. LMB阻止YFPMps1的间期出核,使其在细胞核内积累43-44 9. LMB引起Mps1动粒定位增加44-45 10. LMB引起有丝分裂进程的延缓45-47讨论47-50 1. Mps1核输出信号序列的分析47-48 2. LMB处理引起细胞周期进程延长48-49 3 尚需解决的问题49-50结论50-51参考文献51-63致谢63-65硕士期间发表论文65
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京公网安备75号城轨大直径盾构机组装新技术研究--《华南理工大学》2014年硕士论文
城轨大直径盾构机组装新技术研究
【摘要】：经济的发展导致地下空间不断被开发。盾构施工技术已越来越广泛的被应用于各个城市各类地层的地铁、隧道、市政管道等工程领域。近30年来，盾构技术有了飞速的发展，盾构相关的一系列如壁后同步注浆、盾尾密封、盾构始发及接收的技术难题得以解决，使得盾构技术有了较快的发展。地铁建设的城市交通极为复杂、工程用地受到诸多干涉，不易确保。盾构要穿越各类地下结构物，如此使得盾构施工直径及长度越来越大。盾构隧道直径加大，面临了盾构机装配运输的难题。解决了装配运输难题，又面临了盾体分块多，现场组装的难度。由于现场施工环境差，对大盾构的组装也造成了一定的难度，需要耗费大量的时间，且仍会出现诸多质量问题。盾构隧道长度越大，对盾构机掘进性能的要求越高。盾构设备在施工时是无法退出的，施工的结构也无法重复。而且管片外径小于盾构外径，要拆除已拼装的管片也是相当危险。所以，盾构施工的前期工作非常的重要。做好了前期准备工作，才能降低日后盾构机在掘进过程中的高危风险，确保设备的安全运行，保证隧道结构安全。
我们不断创新盾构施工技术，却忽略了决定盾构机性能的重要环节——盾构机组装施工技术。唯有以高标准控制盾构机组装质量，才能降低大直径盾构机施工的风险，从而确保盾构机性能，以便在长距离掘进过程中正常运行。盾构机组装包括盾构机运输、吊装、定位、螺栓连接、焊接、调试等关键工序。盾构机自重大，且分环、分块多，这为现场定位组装带了极大的难度。同时各片体在吊装、焊接过程中极易发生变形。在同类工程实际施工中，即便是耗费大量的时间、人力、物力，都没有达到满意的效果。因此，为保证盾构机组装质量及使用性能，力争在最短的时间内创造最大的效益，本课题对盾构机组装技术进行探讨，研究出一套高效优质的大盾构机组装施工新技术。
本课题通过工程实例，以Φ8780mm盾构机为研究对象，将盾构机组装的各个环节进行分解，从施工实操、质量安全、进度保证、成本控制四个方面对组装技术进行研究，理论结合实际，总结出一套先进、可操作性强、指导意义大的技术成果。
【关键词】：
【学位授予单位】：华南理工大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2014【分类号】：U455.39【目录】：
摘要5-6Abstract6-10第一章 绪论10-15 1.1 课题研究背景10-11 1.2 国内外盾构施工发展与现状11-12 1.3 盾构机型式及结构12-14
1.3.1 土压平衡式盾构机12-13
1.3.2 泥水平衡盾构机13-14 1.4 研究工作的主要内容14-15第二章 Ф 8780 土压平衡盾构机简介15-18第三章 盾构机组装流程研究18-23 3.1 盾构机组装前准备工作18-19
3.1.1 吊装设备机具准备18
3.1.2 组装场地准备18-19
3.1.3 组装前始发井（车站）的准备工作19 3.2 盾构机组装流程19-23第四章 盾构机吊装技术研究23-32 4.1 盾构机吊装技术23-30
4.1.1 始发托架的吊装23
4.1.2 45 吨电机车、台车、连接桥吊装23-24
4.1.3 A 环片体 3 和 B 环片体 3 的吊装24
4.1.4 主驱动吊装24-25
4.1.5 A 环片体 2、4、1 的吊装25
4.1.6 B 环片体 2、4、1 吊装25-26
4.1.7 CD 环吊装26-27
4.1.8 垂直水平梁的吊装27
4.1.9 EF 环片体 2 吊装27-28
4.1.10 螺旋机及张出台的吊装28-29
4.1.11 EF 环片体 1、3 的吊装29
4.1.12 盾体后移，刀盘安装29-30 4.2 盾构机与后配套系统的拼装30-32
4.2.1 盾构机及其后配套的销子连接30-31
4.2.2 盾构机及其后配套的螺栓连接31
4.2.3 盾构机及其后配套的焊接连接31-32第五章 盾构机主体焊接施工技术研究32-38 5.1 人员控制措施32 5.2 焊材准备32-33 5.3 焊接方法控制33-34
5.3.1 采用合理的装配、焊接顺序及方向33
5.3.2 缩小焊接区与结构整体之间的温差（预热法、冷焊法）33-34 5.4 焊接施工技术34-36
5.4.1 纵缝焊接施工技术34-36
5.4.2 环缝焊接施工技术36 5.5 焊缝质量检验措施36-38
5.5.1 外观检测37
5.5.2 超声波探伤37
5.5.3 磁粉探伤37
5.5.4 着色探伤37-38第六章 盾构机调试及试运行38-43 6.1 调试项目38-39 6.2 盾构机试运行39-43
6.2.1 土仓压力、推力、出土量、出土速度的控制39-40
6.2.2 渣土改良技术40-41
6.2.3 壁后注浆的控制41-42
6.2.4 注浆压力的控制42-43第七章 盾构机拆装技术研究43-48 7.1 拆装前的准备工作43-44
7.1.1 停机43
7.1.2 盾构机清洁43
7.1.3 吊耳焊接、安装43-44
7.1.4 定位块焊接安装44 7.2 盾构机主体与后配套分离44-45
7.2.1 管线拆除44
7.2.2 连接桥与张出台的分离44-45 7.3 盾构机主体拆装技术45-48
7.3.1 刀盘吊装45
7.3.2 E、F 环片体 1、3 吊装45
7.3.3 张出台后段吊装45
7.3.4 张出台前段吊装45
7.3.5 拼装机吊装45-46
7.3.6 CD 环片体 1 吊装46
7.3.7 垂直水平梁，CD 环片体 2、4 吊装46
7.3.10 CD 环片体 3、EF 环片体 2 吊装46
7.3.11 B 环片体 1、2、4 吊装46
7.3.12 A 环片体 1、2、4 吊装46
7.3.13 主驱动吊装46-47
7.3.14 A 环片体 3、B 环片体 3 吊装47
7.3.15 螺旋机前移至接收架吊出47
7.3.16 台车前移，连接桥吊出47
7.3.17 1#、2#、3#、4#台车依次吊出47-48第八章 应用与验证48-50 8.1 本成果在同行业具有一定的先进水平48 8.2 本成果实用性强，可直接指导施工48 8.3 成果的可靠性分析48-49 8.4 成果的局限性分析49-50第九章 总结50-52参考文献52-53攻读硕士学位期间取得的研究成果53-54致谢54-55附件55
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京公网安备75号增值业务统一认证鉴权架构的研究与实现--《北京邮电大学》2010年硕士论文
增值业务统一认证鉴权架构的研究与实现
【摘要】：当前,增值业务的快速发展凸现其重要性,而巨大发展潜力空间更将使其成为运营商未来发展的重要支柱。由于现网各类增值业务平台的建设都是为满足本类业务的需求而分别进行的,缺乏统一的考虑和设计,存在用户管理分散、预付费支持不足、缺乏统一客服支持、全国性业务管理困难等历史问题。为解决以上问题,本文提出采用增值业务鉴权中心(VAC)的形式,实现增值业务统一认证鉴权架构,以解决增值业务管理问题,将用户终端、核心通信网络、增值业务系统、营帐支撑系统、SP应用紧密衔接起来,对各类业务平台的定购、鉴权、扣费、批价、散号码进行统一管理,实现灵活多样的受理方式和套餐组合。本研究课题的实现,可以提高新业务开展效率,有效降低运营成本,完善增值业务价值链、业务内容的合作,整合和强化现有的市场营销环节,提升用户的体验和服务水平,对于未来增值业务发展构架和演进趋势具有巨大意义。
论文出自“中国联通增值业务鉴权中心项目”,通过对目前尚待解决问题的剖析,结合前期综合增值业务平台(VASP)试点经验,确定了VAC的研究目标、定位、功能需求,以此为切入点,对VAC主要功能需求的实现方式和业务流程进行了设计。
论文作者在项目组中主要负责对周边网元的接口规范进行定义和设计,对VAC相关访问流程进行设计和优化,最终制定了增值业务典型业务的统一认证鉴权业务流程,从理论上成功将VAC纳入到增值业务体系架构中。
作者同时参与了VAC试验平台的建设和测试验证工作,通过在现网环境下对几项典型业务流程的测试,从实践上证明通过VAC实现增值业务的统一认证鉴权是切实可行的。
课题解决了由于用户管理分散,导致增值业务定制信息与帐务信息分离的问题,提高了增值业务组合营销能力；完善了各项增值业务对预付费用户进行实时扣费方案；解决了散号码的后预属性互转和携号转品牌的问题；实现了统一客服视图,提升了客服中心对用户的服务提供能力；解决了全国性增值业务管理问题,为业务综合套餐、组合式营销、二次卡回收批量退定等长期困扰运营商的难点课题建立了解决方案。
【关键词】：
【学位授予单位】：北京邮电大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2010【分类号】：TN929.5;F626【目录】：
摘要4-6ABSTRACT6-11第一章 引言11-13 1.1 课题背景11 1.2 课题任务11-12 1.3 论文结构12-13第二章 项目背景13-17 2.1 中国联通增值系统建设情况13-14 2.2 前期联通综合增值业务平台建设情况14-15 2.3 目前尚待解决的问题15-16 2.4 本章小结16-17第三章 增值业务鉴权中心需求分析17-22 3.1 研究目标17 3.2 VAC的定位17-18 3.3 VAC的系统功能18-21
3.3.1 用户信息管理18
3.3.2 定购关系管理18-19
3.3.3 认证19
3.3.4 鉴权19
3.3.5 话单生成19
3.3.6 一次批价19
3.3.7 预付费实时计费19
3.3.8 CP/SP资料管理19
3.3.9 业务系统配置19-20
3.3.10 流量控制与过载保护功能20
3.3.11 系统统计与分析20-21 3.4 本章小结21-22第四章 VAC各主要功能的实现方法设计22-29 4.1 用户信息管理的实现方法22-23
4.1.1 用户状态信息管理实现方法22
4.1.2 用户属性信息管理实现方法22-23
4.1.3 用户伪码管理实现方法23 4.2 定购关系管理的实现方法23-24 4.3 认证功能的实现方法24 4.4 鉴权功能的实现方法24-26 4.5 话单生成的实现方法26 4.6 预付费实时计费的实现方法26-27
4.6.1 OCS用户的预付费实时计费实现方法26
4.6.2 智能网用户的预付费实时计费实现方法26-27
4.6.3 预付费实时计费的统一实现要求27 4.7 CP/SP资料管理的实现方法27-28 4.8 本章小结28-29第五章 VAC与周边网元的接口设计29-34 5.1 VAC与周边网元的接口需求29 5.2 与BSS间的接口29-31
5.2.1 与PRM间的接口29-30
5.2.2 与CRM间的接口30-31
5.2.3 与Billing间的接口31 5.3 与OCS/SCP/PDSCP的接口31-32 5.4 与增值业务系统间的接口32 5.5 与SP间的接口32 5.6 与总部VAC间的接口32 5.7 与网管系统间的接口32-33 5.8 本章小结33-34第六章 典型业务流程设计34-42 6.1 业务定制34-36
6.1.1 增值系统发起的定制34-35
6.1.2 BSS发起的定制35-36 6.2 业务退定36-37
6.2.1 增值系统发起的退定36-37
6.2.2 BSS发起的退定37 6.3 定制业务使用37-40
6.3.1 用户发起的定制业务使用37-39
6.3.2 SP下发到用户的定制业务使用39-40 6.4 点播业务使用40-41 6.5 本章小结41-42第七章 现网环境的搭建与验证42-51 7.1 建设目标42 7.2 组网方案42-44 7.3 主要设备配置建议44-45 7.4 统一认证鉴权测试用例及结果45-50
7.4.1 增值业务侧发起的定购46-47
7.4.2 CRM侧发起的定购47
7.4.3 增值业务侧发起的退定47-48
7.4.4 CRM侧发起的退定48-49
7.4.5 OCS定制用户的业务下发49-50
7.4.6 SCP用户的点播业务50 7.5 验证结论50-51第八章 结束语51-53 8.1 论文工作总结51 8.2 问题和展望51-53附录1:缩略语和术语53-55 缩略语53 术语53-55参考文献55-56致谢56
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